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《日用化學工業(yè)雜志》2014年第五期

1.實驗方法

1.1救必應干浸膏制備把救必應藥材(鐵冬青樹皮)洗凈、曬干后，進行超細粉碎，再用φ=70%乙醇進行提取并進行板框壓濾后得提取液，提取液經(jīng)減壓濃縮和真空干燥后即得救必應干浸膏。

1.2急性毒性測定腹腔注射法:取救必應干浸膏15g，加10g吐溫80溶解后再加75g純凈水配制成試驗樣溶液;配制質(zhì)量分數(shù)為10%的吐溫80水溶液作為對照樣溶液。取小鼠70只，每只體重約為18～20g，雌雄各半，試驗前禁食12h。按照3．25，2．76，2．35，2．00，1．70和1．44g•kg－1注射劑量把小鼠分6組(每組10只，雌雄各半)注射試驗樣溶液，剩余10只注射對照樣溶液。注射完后1和4h分別觀察1次，以后每天上午、下午各觀察1次，共7d，觀察其行為表現(xiàn)、運動、進食情況及中毒表現(xiàn)和死亡數(shù)。灌胃法:取救必應干浸膏加蒸餾水研磨配成質(zhì)量分數(shù)為40%的水溶液，分別以16．00，12．80，10．24，8．19，6．55和5．24g•kg－1劑量把小鼠分6組，每組8只，早、晚各灌胃一次，對其行為表現(xiàn)進行觀察，共3d。

1.3亞慢性毒性測定大鼠試驗:取大鼠96只，每只體重約為(130±20)g，雌雄各半，按照性別隨機分成對照組和試驗組，每組24只。為避免大鼠間交配懷孕而影響體重測量，將雌雄分籠喂養(yǎng)，均飲冷開水。救必應干浸膏按其小鼠半數(shù)致死量(LD50，為(2．022±0．155)g•kg－1)的1/15，1/15×30%和1/15×10%即135.0，40．0和13．5mg•kg－1•d－1分為高、中、低劑量組。為保證用量的準確，避免人為刺激或損傷，將救必應干浸膏均勻拌入飼料內(nèi)，制成顆粒飼料，自由進食，次日稱剩余飼料，折算救必應干浸膏實際攝入量。對照組喂食足量的基礎飼料。所有大鼠每2周稱1次體重，試驗組大鼠按體重增長調(diào)整添加救必應干浸膏的用量，同時每日檢測進食和進水量，觀察大鼠毛色及行為活動情況，連續(xù)3個月。各劑量組和對照組3個月后處死2/3大鼠，眼球取血，做血常規(guī)和血生化檢查，取各主要臟器稱重并做組織病理學檢查。試驗組剩余1/3大鼠于停止喂食救必應干浸膏飼料1個月后處死，對照組剩余1/3大鼠也于1個月后處死，重復前述檢查項目。狗試驗:取狗19只，體重約為(8．0±1．6)kg，檢疫1周后，隨機分為對照組(4只)，高劑量組(5只)，中劑量組(5只)和低劑量組(5只)。參照大鼠使用救必應干浸膏的添加量推算出狗每日所用高、中、低3個劑量為39．12，11．74和3．91mg•kg－1，拌于直徑約3．0cm的肉丸(由面粉、瘦豬肉和少量肥豬肉組成，蒸熟后食用)內(nèi)，每日喂1丸。對照組喂無救必應干浸膏的肉丸。各組每2周稱1次體重，每日記錄進食量，觀察其行為表現(xiàn)、運動、肌肉張力、刺激反應、瞳孔大小及眼結(jié)膜、腺體分泌、呼吸等一般情況，連續(xù)喂食3個月。分別于喂食前和喂食45和90d后進行靜脈采血做血常規(guī)和血生化檢查，采尿液做尿常規(guī)檢查。3個月后，高、中、低劑量組及對照組分別處死4，4，4和3只狗，稱主要臟器質(zhì)量及進行組織病理學檢查。停止喂食救必應干浸膏肉丸1個月后處死剩余的狗，同時處死對照組的1只狗，檢查血常規(guī)和血生化項目。

1.4基因突變檢測采用沙門氏菌/回復突變試驗(Ames試驗)，具體方法見《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》(2007年版)。該試驗用來判斷受試物是否為致突變物，用TA97，TA98，TA100和TA1024個試驗菌株測定，以S9為誘變劑。先采用滲入法，加誘變劑(以S+9表示)與不加誘變劑(以S－9表示)，如果受試物的平均回變菌落數(shù)是空白對照的平均回變菌落數(shù)2倍或2倍以上，且存在劑量－回變菌落數(shù)關(guān)系者，則判斷受試物是致突變陽性，否則就是致突變陰性。再采用點試法，加誘變劑(以S+9表示)與不加誘變劑(以S－9表示)，并采用不同濃度的受試物溶液浸濕滅菌圓濾紙片邊緣，只要有一個試驗菌株為陽性，即該受試物是致突變陽性;如果4個試驗菌株均為陰性，即該受試物是致突變陰性。同時做陽性對照試驗，檢驗試驗的有效性。

1.5染色體畸變的檢測采用哺乳動物細胞微核試驗，具體方法見《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》(2007年版)。以受試物處理大鼠和狗，處死然后取骨髓，制片、固定、染色，于顯微鏡下計數(shù)淋巴細胞中的微核。如果與對照組比較，處理組淋巴細胞微核出現(xiàn)率有統(tǒng)計學意義的增加，并有劑量－反應關(guān)系，則可認為該受試物是哺乳動物體細胞的致畸變物，反之則可認為該受試物是致畸變陰性。試驗與亞慢性毒性試驗同時進行，大鼠淋巴細胞微核出現(xiàn)率正常值為0～0．1%，狗淋巴細胞微核出現(xiàn)率正常值為0～0．9%。

1.6對口腔黏膜刺激性的檢測制備含救必應干浸膏質(zhì)量分數(shù)分別為0．2%，1%和5%的試驗樣牙膏，對照樣牙膏為不含救必應干浸膏的普通牙膏。家兔40只，體重為(1．86±0．27)kg，隨機分為2組。其中損傷組(20只)用梅花針刺入家兔口腔頰側(cè)黏膜，直至出血為止，剩余家兔為非損傷組(20只)。2組均用含救必應干浸膏質(zhì)量分數(shù)分別為0.2%，1%和5%的試驗樣牙膏(每個質(zhì)量分數(shù)對應5只家兔)和對照樣牙膏(5只家兔)涂于家兔口腔頰側(cè)黏膜，每日1次，分別給牙膏5和10d，涂抹期間觀察局部黏膜反應。不同組分別于給牙膏5，10d和停用牙膏10d后殺死1只家兔，取涂牙膏部位口腔黏膜送病理切片檢查。

1.7對牙齦黏膜刺激性的檢測家兔10只，隨機分為2組，每組5只，試驗組體重為(1．99±0．19)kg，對照組體重為(1．86±0．27)kg，試驗組所用牙膏中救必應干浸膏的質(zhì)量分數(shù)為1%，對照組為不含救必應干浸膏的普通牙膏。2組均用牙膏模擬刷牙，每日1次，分別給牙膏5和10d，并于給牙膏5，10d和停用牙膏10d后分別殺死1只家兔，取涂牙膏部位牙齦黏膜送病理切片檢查。

2結(jié)果與討論

2.1救必應干浸膏的急性毒性

腹腔注射試驗數(shù)據(jù)見表1。根據(jù)藥物研究技術(shù)指導原則及LD50的計算方法，由表中數(shù)據(jù)計算出的LD50為(2．022±0．155)g•kg－1;注射對照樣的小鼠未見異常反應，無死亡。灌胃法試驗中，16．00和12．80g•kg－1劑量組出現(xiàn)毒性反應，毒性反應在24～48h內(nèi)消失，小鼠恢復正常活動，無死亡;其余4組未見異常反應。按照急性毒性數(shù)據(jù)分級，該救必應干浸膏為實際無毒級物質(zhì)。

2.2救必應干浸膏的亞慢性毒性

亞慢性毒性試驗結(jié)果表明，該救必應干浸膏在經(jīng)口反復接觸時是安全的，詳細情況分析如下。

2.2.1一般體征喂救必應干浸膏期間的各組動物，無異常行為表現(xiàn)，運動正常，皮毛有光澤，無脫毛，狀況良好，進食量各組間無明顯差異。

2.2.2尿常規(guī)檢查各組狗喂救必應干浸膏前后，狗的尿液pH、尿蛋白、尿糖及隱血試驗檢查值均在正常范圍，各組間比較無顯著差異。

2.2.3血常規(guī)檢查大鼠喂救必應干浸膏3個月后高劑量組血小板計數(shù)、中劑量組血紅蛋白水平較對照組低(P＜0．05)，但仍在正常范圍內(nèi)，停喂救必應干浸膏后亦無明顯變化。各組大鼠血常規(guī)檢查均在正常范圍內(nèi)。各組狗喂救必應干浸膏前后血常規(guī)各項指標均在正常范圍內(nèi)，組間無顯著差異。

2.2.4血生化檢查喂大鼠高、中和低劑量救必應干浸膏3個月后，血膽固醇水平較對照組高(P＜0．05);但喂中和低劑量救必應干浸膏的大鼠血膽固醇水平仍在正常范圍內(nèi);喂高劑量救必應干浸膏的大鼠血膽固醇水平則大于正常值，停用1個月后下降至正常值。其余血生化指標均在正常范圍內(nèi)，組間比較也無明顯差異。喂高和中劑量救必應干浸膏的狗在45和90d后，血膽固醇水平較試驗前明顯升高，并高于正常值，停用1個月后下降至正常值。其余血生化指標均在正常范圍內(nèi)，組間比較也無明顯差異。

2.2.5臟器檢查喂救必應干浸膏3個月及停用1個月后分別處死的動物，各臟器大小及色澤正常，無充血、水腫及壞死，各組間臟器重量無明顯差異。各組動物的心、肝、肺、脾、腎、胃、腸道及性腺組織結(jié)構(gòu)正常，除個別動物的肺或腎有輕度炎癥外，其余無明顯病理學改變。各組之間炎癥的變化無明顯差異。

2.3救必應干浸膏致基因突變的風險

沙門氏菌/回復突變試驗(Ames試驗)結(jié)果見表2，表3和表4。由表中數(shù)據(jù)可知，在滲入法試驗過程中，救必應干浸膏加入S9(0．3mL/皿)和不加入S9的平均回變菌落數(shù)相比較無明顯增加，不同劑量救必應干浸膏的平均回變菌落數(shù)與空白對照的平均回變菌落數(shù)相比也無明顯增加，且不存在劑量－回變菌落數(shù)關(guān)系。點試法均為陰性。陽性對照物(2－氨基芴、疊氮化鈉和絲裂霉菌)的滲入法和點試法測試均為陽性。由此說明該救必應干浸膏為致突變陰性，即無致突變風險。

2.4救必應干浸膏致染色體畸變的風險

哺乳動物細胞微核試驗的結(jié)果見表5和表6。根據(jù)表中的數(shù)據(jù)可知，大鼠和狗喂救必應干浸膏3個月后的淋巴細胞微核出現(xiàn)率與對照組比較無明顯差異，且均在正常值范圍內(nèi)。由此說明該救必應干浸膏為微核試驗陰性，即無致染色體畸變風險。

2.5救必應干浸膏對口腔黏膜的刺激性

非損傷組在涂抹含救必應干浸膏牙膏和對照樣牙膏期間，家兔口腔黏膜無充血、水腫、破潰、糜爛，亦無水泡、出血點等現(xiàn)象，家兔口腔黏膜病理學切片在普通光學顯微鏡下均未見病理性損傷。損傷組在涂抹試驗樣牙膏和對照樣牙膏期間，肉眼可見一些家兔局部充血、水腫、破潰、糜爛現(xiàn)象，在普通光學顯微鏡下觀察家兔口腔黏膜病理學切片亦見明顯的損傷，但各組間無明顯差異。試驗結(jié)果表明，含救必應干浸膏牙膏對正常狀態(tài)下的口腔黏膜無刺激性。救必應干浸膏應用于牙膏對口腔黏膜無額外增加的刺激性。

2.6救必應干浸膏對牙齦黏膜的刺激性

在刷牙期間，肉眼觀察試驗組和對照組牙齦黏膜，均無充血、水腫、破潰、糜爛及牙齦增生等改變，病理切片檢查未見明顯的損傷性變化。試驗結(jié)果表明，含救必應干浸膏牙膏對正常狀態(tài)下的牙齦黏膜無刺激性。救必應干浸膏應用于牙膏對牙齦黏膜無額外增加的刺激性。

3結(jié)論

小鼠腹腔注射法試驗結(jié)果表明，救必應提取物的LD50為(2．022±0．155)g•kg－1;灌胃法試驗結(jié)果表明，10．24g•kg－1及更低劑量試驗組無毒性反應;按照急性毒性數(shù)據(jù)分級，救必應提取物屬實際無毒級物質(zhì)。亞慢性毒性試驗結(jié)果表明，救必應提取物在經(jīng)口反復接觸時是安全的。基因突變和染色體畸變的檢測表明，救必應提取物無致突變風險和無致染色體畸變風險。口腔黏膜試驗和牙齦黏膜試驗表明，救必應提取物應用于牙膏對口腔黏膜和牙齦黏膜無刺激性。綜合以上結(jié)果，按照牙膏用中藥安全性判定的基本原則，救必應提取物可安全用于牙膏等口腔護理品中。

作者：徐春生徐文霞單位：廣州市牙博士口腔護理研究院