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1材料與方法（MaterialsandMethods）

1.1樣品采集

污水樣品分別采集于北京市GBD污水處理廠（Anaerobic/Aerobic(A/O）工藝，簡稱G-AO）、QH污水處理廠（Anoxic-Anaerobic-Aerobic（A2/O）工藝，簡稱Q-A2O）、JXQ污水處理廠（OxidationDitch工藝，簡稱J-OD）和WJC污水處理廠（SequencingBatchReactor（SBR）工藝，簡稱W-SBR）。以上四個污水處理廠工藝概況如表1。采樣時間自2010年7月至2011年5月，考慮到夏末秋初是流行病的高發季節，故在2010年7、8、9月各采樣一次，而在秋（2010.11）、冬（2011.2）、春季（2011.5）各采樣一次。每次所取水樣充分混合后保存于樣品冷藏箱，并在兩小時內帶回實驗室。

1.2試驗方法

1.2.1樣品預處理及細菌DNA提取：進水樣品和初沉池出水樣各100mL，各工藝中段樣品10mL，剩余污泥樣品5mL，二沉池出水500mL，且各采樣點進行等體積平行取樣。水樣處理采取抽濾的方式，將樣品通過0.22μm的濾膜，微生物被截留在濾膜上，將濾膜剪碎，放入DNA提取試劑盒配套的管子中。按照FASTprep系列試劑盒(MP，美國)的說明書進行逐步提取(Nazarianetal.,2008)。且每個平行樣品提取時均做一重復，提取后將每個平行樣品的兩份DNA溶液進行混合，以減少單一水樣采集和DNA提取時造成的誤差。最后采用Nanodrop微量分光光度計(Thermo，美國)進行DNA的含量測定，并對所提取基因組DNA分裝備份保存于-20℃，以用作后續PCR及定量PCR分子生物學分析中的DNA樣品。

1.2.2PCR引物特異性及反應體系：所用引物如表2所示，其中對于大腸桿菌檢測引物的選用主要參照Bej,Tsai等人(Tsaietal.,1993；Bejetal.,1991)和Maheuxa等人(Maheuxetal.,2009)，研究證實uidA基因具有更好的特異性和靈敏性；沙門氏菌檢測引物的選用主要參照Andreas等人(Hadjinicolaouetal.,2009)和Rahn等人(Rahnetal.,1992)基于invA基因設計引物；而軍團菌特異性引物的選用，則主要依據Miyamoto(Miyamotoetal.,1997)和Sheehan等人(Sheehanetal.,2005；WullingsandvanderKooij,2006；Carvalhoetal.,2007)的研究應用。PCR反應體系（50μL）為：5μLPCR緩沖液；4μL0.25mmol/LdNTPs；1μL10μmol/L正向引物；1μL10μmol/L反向引物；0.25μL20mg/LBSA；0.25μL1.25UTaqDNA聚合酶；2μL水樣DNA（約10ng）；滅菌去離子水36.5μL。反應條件為：95℃預變性5min，95℃變性1min，退火溫度（參見表2）下退火1min，72℃延伸1.5min，整個過程進行35個循環，最后72℃下延伸10min。通過1%（w/v）的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。標準樣品的建立：利用FermentasDNA純化試劑盒（MBIFermentas,加拿大）對上述PCR產物進行純化。連接到pGEM-TEasy載體上（Promega,荷蘭），利用化學方法轉化到DH5-α感受態細胞中（Takara,日本），在37℃，170rpm條件下培養1h。接著將轉化混合液涂布于含有氨卡青霉素（50μg/ml）、X-Gal和IPTG的培養皿中，在37℃下培養15h。通過藍白斑篩選陽性克隆體，采用M13F（5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’）和M13R（5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’）對陽性克隆體中的目標基因片段進行特異性擴增。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測M13PCR產物，采用ABI3730基因測序儀進行測序分析(Attardetal.,2010)。將測序結果提交到NCBI，進行BLAST比對。將插入正確的菌液，利用TIANGEN質粒提取試劑盒（TIANGEN，中國），取3ml菌液進行質粒提取,由nano-drop儀器測定該質粒濃度，其質量濃度為ng/μl，即質粒DNA在單位微升溶液中的質量，并可由公式（1）換算成單位（copies/μl），從而以該質粒作為定量PCR的標準品。定量PCR反應：以上述已知質粒濃度的標準品為標準模板，進行10倍梯度稀釋，。以水樣中各細菌DNA為待測模板，采用與普通PCR相同的引物（表2）。采用實時熒光定量PCR，藥品采用TaqSYBRGREEN1(Takara，日本)，其反應總體系為25μl：12.5μl的SYBRGreen1染料（2X）；0.5μl100umol/L正向引物；0.5μl100umol/L反向引物；0.5μl的ROX染料（50X）；0.5μl的BSA；2μl水樣DNA（約10ng）；滅菌去離子水8.5μl。將定量PCR混合液放入8連管(ABI美國)中，用超凈管蓋封閉，將反應管放入定量PCR儀(ABI7300，美國)中進行分析。其中標準樣品和待測樣品均為同一批次內進行平行測定3次，并計算3次CT值間的變異系數，以驗證結果的精確度。最終結合SDSsystemsoftware軟件分析，得到動力學曲線及標準曲線，進而計算出單位毫升待測水樣溶液中相應細菌基因的拷貝數，為絕對定量。單位為copies/(ml水樣)，記作copies/ml。對三種菌的標準曲線進行線性回歸分析得到標準曲線方程分別為：（1）大腸桿菌標準曲線方程：CT=-3.3511X0+40.073，R²=0.9958；（2）沙門氏菌標準曲線方程：CT=-3.1902X0+35.142，R²=0.9902；（2）軍團菌標準曲線方程：CT=-3.1674X0+38.22，R²=0.9958。其中，X0為標準模板濃度的對數。三種菌的標準曲線相關系數R²均大于0.990，且對同批次3個平行樣品間Ct值的變異系數分析發現，大腸桿菌、沙門氏菌和軍團菌的變異系數均較小，分別小于等于1.541%、2.326%和2.115%。說明所建立的標準曲線具有較高的精確度和可信度。

2結果與分析（ResultsandAnalysis）

2.1不同污水處理廠及四季中大腸桿菌調查分析利用定量PCR技術，連續對Q-A2/O、J-OD、W-SBR和G-A/O四個污水處理廠中大腸桿菌濃度變化進行為期一年的調查，結果如圖1所示。整體而言，四個季節中大腸桿菌在四個污水處理廠各水處理階段都可檢出。從大腸桿菌進水濃度的季節性分布來看，其中以夏季進水中大腸桿菌濃度為最高，在107-108copies/ml，明顯高于其他三個季節一個數量級左右，這也與Molleda(Molledaetal.,2008)和Thurston(Thurstonetal.,2001)等人針對大腸桿菌的季節變化研究結果基本一致；大腸桿菌在冬季進水中的濃度普遍偏低，在106copies/ml左右。從四個污水處理廠大腸桿菌出水濃度來看，也表現出明顯的季節性差異，尤以夏季出水濃度最高，為105copies/ml左右，春秋次之，而基本以冬季為最低，主要在103-104copies/ml之間。盡管各污水處理廠中大腸桿菌出水濃度依舊較高，但相比于進水濃度107-108copies/ml，已大致減少了三個數量級以上，可見四個污水處理廠對大腸桿菌的去除均表現出了良好的效果，其中以G-A/O去除效果最好，四季平均去除效率達99.88%；其次為W-SBR和J-OD，二者四季平均去除效率分別為99.73%和98.45%，盡管Q-A2/O相較于其他三者，其處理效果有一定波動，四季中去除效率最低也可達90%，而四季平均去除率為96.45%，可見其去除效果已屬良好。但從各廠污泥樣品中濃度來看，主要集中在105copies/ml左右，最高甚至達106copies/ml以上，相較于其它污水處理工藝段程度均有所回升，且高于出水濃度近一個數量級。此外，大腸桿菌在Q-A2/O的沉砂池、J-OD的沉砂池以及G-A/O的初沉池中的分布濃度相較于以上三個工藝進水中大腸桿菌的濃度而言，并未表現出顯著性的降低。

2.2不同污水處理廠及四季中軍團菌調查分析軍團菌在Q-A2/O、J-OD、G-A/O和W-SBR四個污水處理廠及四季中的含量變化如圖2所示。軍團菌在四個污水處理廠中的含量變化相較于大腸桿菌的分布變化來說，二者差異顯著。盡管軍團菌在各污水處理階段均可檢出，但就進水季節性變化來說，四個污水處理廠的四季進水濃度基本接近，在104-105copies/ml，并未顯示出明顯的季節性變化。從各污水處理廠對軍團菌處理效果來看，軍團菌數量減少并不明顯，出水濃度仍基本維持在104copies/ml左右，與進水幾乎持平，甚至部分水廠出現二沉池出水濃度反而升高的現象。此外，從軍團菌在各污水處理廠工藝段中的分布情況來看，也有差異。其中，在污水進入Q-A2/O、W-SBR與G-A/O的曝氣階段及回流污泥和剩余污泥階段后，軍團菌濃度出現了不同程度的升高，其中以W-SBR升高幅度最為明顯，其曝氣后污泥中軍團菌濃度相比于進水濃度升高約2個數量級，在106copies/ml以上；出水中濃度下降亦不明顯；而軍團菌在J-OD中的濃度變化表現出了與前三者明顯的差異，其氧化溝及回流污泥中軍團菌數量相比于進水，銳減數量超2個數量級，濃度不到102copies/ml的一半，而軍團菌在出水中卻表現出了激增，排放濃度超過103甚至達到104copies/ml。就工藝類型對軍團菌去除效果來看，以G-A/O去除效果最好，四季平均去除效率達93.48%；其次為J-OD，可達90%，而Q-A2/O只表現出了一定的去除效果，四季平均去除率為41.63%，且主要在秋冬兩季有去除效果，而W-SBR工藝出水中濃度反而高于進水濃度。

2.3不同污水處理廠及四季中沙門氏菌調查分析如圖3所示，為沙門氏菌在四個污水處理廠及四季的分布變化調查結果。沙門氏菌在四個污水處理廠中四季的分布變化與大腸桿菌、軍團菌也大不相同，其進水濃度較低，基本在102-103copies/ml，而在J-OD和G-A/O的春季進水中均未檢出，除了在冬季進、出水中保持了相對較高含量外，并未表現出明顯的季節性變化規律；就去除效果來看，經各污水處理廠處理后，出水中沙門氏菌濃度有一定的削減，但并不明顯，其中以G-A2/O和Q-A/O去除效果相對較好，J-OD、W-SBR較弱；相對其它季節而言，冬季進水中沙門氏菌的濃度相對較高，四個污水處理系統對其去除效果并不理想，出水中濃度降低并不顯著，可見冬季較低的溫度對沙門氏菌影響不大。另一方面，從沙門氏菌在各處理工藝沿程分布情況來看，除其在Q-A2/O、J-OD的沉砂池及G-A/O的初沉池中均可檢出外，在此四個工藝處理的其他階段均未檢出，尤其在剩余污泥樣品中也未有沙門氏菌檢出，這與魏夢楠(魏夢楠,2010)針對污水再生水檢測研究結果基本一致。

3討論（Discussion）

我國最新頒布的城鎮污水處理廠污染物排放標準（GBl8918-2002）中僅對糞大腸桿菌（其中大腸桿菌屬于糞大腸菌群中的一種）數量做出明確規定，但未涉及其它高致病菌的限定。因此，對于污水處理系統中其它高致病菌的分布開展調查研究顯得十分必要。從本研究針對北京市Q-A2/O、J-OD、G-A/O和W-SBR四個污水處理廠為期一年的調查結果來看，大腸桿菌在四種系統中的濃度變化表現出明顯的季節性規律，其在夏季的進水和出水中濃度為最高；沙門氏菌僅在冬季進、出水中保持了相對較高含量；而軍團菌并未表現出明顯的季節性規律。就大腸桿菌、軍團菌和沙門氏菌在污水處理系統中含量差異而言，軍團菌在四種系統進水中濃度在104-105copies/ml之間，較大腸桿菌進水濃度低約2個數量級，而其在出水中的濃度卻與大腸桿菌出水中濃度較為相近，主要集中在104copies/ml左右；沙門氏菌在四種系統進水中濃度低于103copies/ml，不及進水中大腸桿菌濃度的1/1000，且沙門氏菌主要在冬季進、出水中有所檢出，而在水處理的主要工藝段并未被檢出。可見，所調查的北京市四個污水處理廠污水中的病原菌主要還是以大腸桿菌為主，軍團菌次之，沙門氏菌為最少。此外，研究結果也從側面反映出大腸桿菌、軍團菌和沙門氏菌在四種系統中的分布并未表現出直接的相關性，這與早期Rahman(Rahmanetal.,1996)在有關大腸桿菌、沙門氏菌及其他病原菌的水域傳染病相關性研究的結果一致。從季節變化對病原菌去除效果的影響來看，四種系統在冬季對三種病原菌的去除率均較低；而在夏季，除軍團菌外，四種系統對于大腸桿菌和沙門氏菌的去除率最好，可見季節性變化對于病原菌的去除效果具有一定的影響，這一結果與印度污染控制委員會07年所的水質報道(Bhawan,2008)結果基本一致。然而，在夏季，雖然去除率高，但排放的病原菌濃度依然保持較高水平，尤其軍團菌在夏季的排放濃度較其他季節高出很多，這也進一步印證了為什么往往在夏季水媒型傳染病暴發風險較高。在冬季，沙門氏菌在四種系統中含量相對較高，這與Stampi等(Stampietal.,2000)研究發現沙門氏菌在溫度較低和濕度較高的10月—3月期間含量更高的結果基本一致，其原因是沙門氏菌在溫度較低和濕度較高的冬季表現出更強的活性，從而更容易在與其他菌群競爭中獲優勢；在夏季，溫度較高，有利于其它細菌繁殖生長，含量較低的沙門氏菌在與其它菌群競爭中處于劣勢，較難存活。此外，PlachaI(Plachaetal.,2001)也研究發現相比于溫度較高的夏季，沙門氏菌在溫度更低的冬季活性更高，而且發現在夏季和冬季相同pH變化幅度下，夏季pH的波動更容易導致沙門氏菌的死亡。本研究發現大腸桿菌和軍團菌在剩余污泥樣品中的分布較出水中更高，這與Gaspard等(GaspardPetal.,1997)對法國89個污水處理廠污泥中病原物分布調查發現的結果一致。以上結果也與多數研究(Deportesetal.,1995;Sahlströmetal.,2003;Lewisetal.,2002)一致，證實了微生物易于被活性污泥絮體吸附而沉積，因此更多研究者更傾向將活性污泥看作微生物生長繁殖的溫床。此外，軍團菌在除G-A/O外的其他三種系統活性污泥中濃度均高于進水中濃度，可見軍團菌對活性污泥工藝有更好的適應性。然而，沙門氏菌在剩余污泥樣品中均未檢出，而部分出水中出現沙門氏菌濃度上升的現象。究其原因，可能一方面是由于在污水處理中，沙門氏菌主要分布在水相，很少進入活性污泥絮體之中；或者又從污泥絮體中分離出來，如Hendricks(Hendrick,1971)研究發現，近90%沙門氏菌可從人工濕地的基質和沉積物中分離出來，重新進入水體，進而在部分出水中出現濃度升高現象。另一方面，在活性污泥中，占優勢的多是本土微生物，而沙門氏菌來源于腸道，數量本就不多，進入曝氣池后，沙門氏菌在與其他數量巨大的細菌競爭中往往處于劣勢，進而走向死亡；再者，由于原生動物的捕食作用(Curdsetal.,1982;Pillaietal.,1942)，使得沙門氏菌數量更低。此外，四種工藝對大腸桿菌、軍團菌和沙門氏菌三種菌的去除效果也各不同。相較于其他三個工藝，G-A/O工藝對大腸桿菌和軍團菌的處理效果較好。其對大腸桿菌和軍團菌的四季平均去除效率最高，分別達99.88%和93.48%。然而，即便四個污水處理廠對大腸桿菌去除效率可達90%以上，大腸桿菌在出水中濃度依然較高，維持在104左右，甚至高達105copies/ml，可見二沉池出水中較高濃度的大腸桿菌對生態安全具有不可忽視的潛在危險。在Q-A2/O、W-SBR與G-A/O污水處理過程中，存在軍團菌濃度升高的現象，尤其在W-SBR處理工藝中，軍團菌濃度遠高于進水濃度。據有關軍團菌生長條件的研究（邵祝軍,2005）發現，大量的污泥濃度、原生蟲類和有機物含量均有助于軍團菌的生長。而W-SBR其污水來源100%為生活污水，且系統中污泥濃度較高，有機物含量豐富，軍團菌本身就具有很強的環境適應性，遇到人工創造的良好環境條件（曝氣、有機質等）時，軍團菌即得到大量繁殖和增生，從而表現出濃度反升的現象。而在J-OD氧化溝處理過程中，污泥中的軍團菌數量較少，其原因可能是由于氧化溝污水處理工藝屬延時曝氣工藝，污泥齡較長，污泥穩定化程度高，其不利的環境條件和微生物競爭壓力，導致軍團菌活性降低，致使數量減少；然而在出水中軍團菌濃度又出現升高，可能一方面因為軍團菌具有較強生命力，另一方面，Kuchta等研究(Kuchtaetal.,1985)發現，軍團菌由于沒有相應的噬菌體，且與許多細菌和原蟲存在共生關系，尤其是阿米巴等原生動物不僅可源源不斷的為軍團菌提供所需的營養，而且阿米巴可分泌出厚的囊壁包裹軍團菌，從而可依附于生物膜或寄宿于原蟲這些屏障之中。因而，軍團菌可相應的減輕延時曝氣工藝對其所造成的不利影響，待軍團菌遇見合適的繁殖條件時，將再度“蘇醒”并大量增殖，即病原菌的重新生長現象(Erdaletal.,2003；Iranpouretal.,2002)。正是因為軍團菌對水處理工藝乃至消毒工藝所表現出的超強耐受性，若處理不當，軍團菌可通過出水再次污染地表水，并形成氣溶膠擴散到環境中，進而對公共健康和生態環境造成潛在威脅(Baertschetal.,2007)。另外，需要注意的是，由于細菌死亡后DNA仍可存留一定時間，利用DNA進行定量PCR定量的方法也可能會高估病原菌含量。綜上所述，大腸桿菌和軍團菌在污水處理廠的剩余污泥和出水中仍具有較大的生態和健康風險，應加強二沉池出水或中水回用的消毒強度；如果條件允許，應該適當布點增設病原菌的常規檢測。尤其是軍團菌在夏季出水中含量過高，宜在夏季加強對軍團菌的監測預防。此外，沙門氏菌在冬季出水中濃度也相對較高，也應該引起足夠重視。同時，更應加快對病原菌低成本、高效防治技術的研發，以減少病原菌的環境排放風險。

4結論（Conclusion）

（1）三種病原菌在北京市四個污水處理廠進水中分布主要以大腸桿菌（106-108copies/ml）為主，軍團菌（104-105copies/ml）次之，而沙門氏菌（102-103copies/ml）最少。（2）大腸桿菌在污水處理系統中的分布具有一定的季節變化規律，其在夏季進水和出水中濃度最高，分別在107-108copies/ml和105copies/ml左右；而沙門氏菌和軍團菌在污水中的分布并未表現出明顯的季節性變化現象。（3）從四個污水處理系統對病原菌去除效率來看，以G-A/O對大腸桿菌的去除效率最高，其平均去除率可達99.88%；而各工藝系統并未對沙門氏菌和軍團菌表現出明顯的去除效果。（4）污水處理廠的出水和污泥排放仍存在一定的生態和健康風險。盡管大腸桿菌在四個污水處理系統的去除率均在90%以上，但大腸桿菌在出水和活性污泥中的濃度依然較高，其出水中濃度在103copies/ml以上，而在活性污泥中濃度更高，基本高達105copies/ml。軍團菌在四個污水系統中的削減并不明顯，甚至在W-SBR系統出現出水中濃度高于進水濃度現象，其平均進水濃度2.07×104copies/ml，而平均出水達4.33×104copies/ml，高出進水1倍；此外，軍團菌在Q-A2/O、W-SBR和G-A/O系統的污泥樣品中濃度則更高，其均在8.56×104copies/ml及以上，而W-SBR系統也尤為突出，其污泥中軍團菌濃度相比于進水濃度升高約2個數量級，在106copies/ml以上。沙門氏菌在各污水處理系統進水中含量相對較低，在102-103copies/ml，但其在冬季出水中濃度也相對較高，基本在102copies/ml左右。

作者：易鑫李娟黃京劉新春單位：中國科學院大學資源與環境學院