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1材料與方法

1.1實驗方法

1.1.1病原菌的分離和致病性測定采集新近腐爛的百合鱗莖，采用組織分離法[11]在病健交界組織處切取4mm×4mm小塊，用75％酒精表面消毒30s，再用2%次氯酸鈉消毒7min，無菌水沖洗3次，然后置于PDA培養(yǎng)基上28℃黑暗培養(yǎng)，待長出菌絲后，挑取菌落邊緣進(jìn)行純化，純化后的菌落再進(jìn)行單孢分離培養(yǎng)。病原菌致病性測定根據(jù)柯赫氏法則，用滅菌的接種針在消毒后的鱗莖片上刺孔，將浸有菌液的濾紙片貼在孔上作為有傷接種，同時將浸有菌液的濾紙片貼在未刺孔的鱗莖片上作為無傷接種，將浸無菌水的濾紙片貼在孔上作為對照。接種處理完成后將鱗莖片置于培養(yǎng)皿中保濕培養(yǎng)，5d后觀察并記錄發(fā)病情況，確定病原菌對百合鱗莖的致病性。對接種發(fā)病的鱗莖片再次進(jìn)行病原菌的分離。

1.1.2病原菌鑒定

1.1.2.1病原菌形態(tài)學(xué)觀察將病原菌接種到PDA平板，28℃黑暗培養(yǎng)2-5d，觀察菌落形態(tài)，并在顯微鏡下觀察病原菌的菌絲及孢子的形態(tài)特征，測量孢子大小。

1.1.2.2ITS序列分析將供試菌株接種于PDA培養(yǎng)基中；28℃恒溫培養(yǎng)4d，收集菌絲體，采用CTAB法提取病原菌基因組DNA。ITS通用擴(kuò)增引物為TS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和TS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。擴(kuò)增體系：50µL，基因組模板DNA1µL、10µmol/L上下游引物各1µL、2mmol/LdNTPs5µL、KODDNA聚合酶1µL、10×KODbuffer5µL，加ddH2O補(bǔ)足體積。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s；58℃復(fù)性30s；72℃延伸3min，35個循環(huán)；72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由北京信諾金達(dá)生物技術(shù)有限公司測序。所得測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上用BLAST軟件進(jìn)行同源性比較后，下載同源序列，用MEGA（molecularevolutionarygeneticsanalysis，Version6.0）軟件將病原菌ITS序列與同源序列進(jìn)行比對，并采用鄰接法（Neighborjoining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自舉法（bootstrap）對系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行檢驗，500次重復(fù)。

1.1.3病原菌生物學(xué)特性將直徑5mm的病原菌菌塊分別接種于供試培養(yǎng)基平板（直徑9cm）中央，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分析培養(yǎng)基種類、碳源、氮源、溫度、pH和光照時間對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響。采用PDA、PSA、PMA、LA和LDA培養(yǎng)基；培養(yǎng)溫度分別為5、15、25和35℃；pH分別為5、6、7、8和9；全光照、全黑暗和光照/黑暗各12h；等量葡萄糖、果糖、乳糖和淀粉置換查氏基本培養(yǎng)基中的蔗糖，等量硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀和蛋白胨，置換查氏基本培養(yǎng)基中的硝酸鈉，并設(shè)空白對照。病原菌菌株Z1和Z2分別在以上各條件下培養(yǎng)5d、2d后（因菌株Z2生長速度較快，因此縮短培養(yǎng)時間統(tǒng)計菌落生長狀況），采用十字交叉法測量菌落生長直徑作為菌絲生長狀況指標(biāo)，7d后采用血球計數(shù)板法測量孢子產(chǎn)量。

1.2數(shù)據(jù)分析

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，Duncan氏新復(fù)極差法檢驗處理間差異顯著性。顯著水平p=0.05，每個處理3個重復(fù)。

2結(jié)果與分析

2.1百合鱗莖腐爛病癥狀及致病性蘭州百合鱗莖腐爛病的發(fā)生一般從鱗莖表面破損處開始，初侵染時在破損處形成略顯褐色的侵染點，逐漸擴(kuò)展形成近圓形或不規(guī)則形狀的褐色病斑，病斑中央呈腐爛狀，并逐漸向四周擴(kuò)大，病斑上可見灰綠色霉層，腐爛組織不斷增加，嚴(yán)重時導(dǎo)致整個鱗莖軟化腐爛。從蘭州百合鱗莖腐爛病斑上分離純化得到五株菌株，分別編號為Z1、Z2、Z3、Z4和Z5。致病性結(jié)果表明，僅菌株Z1、Z2單獨接種健康百合鱗莖片后，在接種部位出現(xiàn)腐爛病斑，并伴隨菌絲體大量繁殖，菌株Z2比Z1的侵染能力強(qiáng)，無傷接種也可導(dǎo)致鱗莖片腐爛（圖1-b、c）。菌株Z1和Z2混合接種鱗莖片后，使鱗莖片腐爛更為嚴(yán)重（圖1-d），其病癥與百合鱗莖自然條件下的發(fā)病癥狀相同。從接種發(fā)病部位可分別重新分離到與接種菌相同的菌株，表明所分離到的菌株Z1、Z2均為蘭州百合鱗莖腐爛病病原菌。

2.2病原菌鑒定

2.2.1病原菌形態(tài)從蘭州百合腐爛鱗莖上分離到的病原菌菌株Z1，在PDA培養(yǎng)基上菌絲質(zhì)地致密絲絨狀，中央部分呈絮狀，菌株形成少量菌核，同時伴有滲出液（圖2-a）；菌落反面為無色至淡褐色，后期產(chǎn)生菌核時，會顯現(xiàn)黑褐色斑點（圖2-b）；分生孢子頭初為球形，后呈輻射形；分生孢子梗多生自基質(zhì)，孢子梗200~800μm×8~20μm，壁厚，無色，粗糙；產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)為雙層；分生孢子為近球形，直徑為2.4~6.4μm，壁略粗糙（圖2-c）。病原菌菌株Z2在PDA培養(yǎng)基上生長迅速，菌絲疏松，最初呈白色，后變?yōu)榛液谏▓D2-d），菌落背面呈白色棉絮狀（圖2-e）；假根發(fā)達(dá)，分枝呈指狀或根狀，呈深褐色。孢子囊呈球形或近球形，初期呈白色，老后呈黑色，直徑25~200μm，孢囊孢子呈橢圓形或近球形，淡褐色（圖2-f）。

2.2.2ITS序列分析用ITS通用引物擴(kuò)增出病原菌的通用引物序列，長度分別為594bp（GenBank登錄號：KP172534）和627bp（GenBank登錄號：KP172533）。經(jīng)BLAST分析，菌株Z1、菌株Z2的rDNA-ITS序列分別與黃曲霉和米根霉的同源性最高。在同源性最高的序列中各挑選10個菌株的ITS序列分別與供試菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖3所示，菌株Z1序列與Aspergillusflavus（JF754467.1）的序列親緣關(guān)系最近，且與A.flavus相聚于同一群。如圖4所示，菌株Z2的序列與Rhizopusoryzae（JQ683242.1）的序列親緣關(guān)系最近，且與R.oryzae相聚于同一群。菌株Z1、Z2的ITS序列在NCBI上BLAST結(jié)果與A.flavus和R.oryzae的相似性為分別為99%和99%～100%，進(jìn)而從系統(tǒng)分類學(xué)上進(jìn)一步驗證了菌株Z1和菌株Z2；再結(jié)合病原菌的形態(tài)特征，可以確定菌株Z1為黃曲霉（A.flavus），菌株Z2為米根霉（R.oryzae）。

2.3病原菌的生物學(xué)特性

2.3.1培養(yǎng)基種類對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響A.flavus和R.oryzae兩種病原菌在供試的五種培養(yǎng)基上都能生長，兩種病原菌在百合培養(yǎng)基和百合葡萄糖培養(yǎng)基上菌絲生長和產(chǎn)孢量最大，且在這兩種培養(yǎng)基上的差異不顯著。A.flavus在LA上培養(yǎng)5d后菌落直徑達(dá)19.0mm，R.oryzae在LA上培養(yǎng)2d后，菌落直徑達(dá)40.5mm，7d后產(chǎn)孢量分別為10.35×106個/ml和8.06×106個/ml（圖5）。

2.3.2碳源、氮源對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響兩種病原菌對供試碳源均可利用。A.flavus在葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長速度最大，培養(yǎng)5d后菌落直徑達(dá)20.0mm，而在果糖、乳糖和淀粉為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長速度次之，且三者間差異不顯著。A.flavus在葡萄糖和果糖為碳源的培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最高，而兩者間差異不顯著；在淀粉為碳源的培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量次之，在乳糖為碳源的培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最低（表1）。R.oryzae在葡萄糖和果糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長和產(chǎn)孢量最大，且兩者間差異不顯著；在乳糖和淀粉為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長和產(chǎn)孢量次之，且兩者間差異也不顯著（表1）。A.flavus在蛋白胨和硝酸銨為氮源的培養(yǎng)基上菌絲生長速度最大，且兩者間差異不顯著，但在蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量高于硝酸銨為氮源的培養(yǎng)基，在硫酸銨和硝酸鉀為氮源的培養(yǎng)基上菌絲生長速度和產(chǎn)孢量都較低（表1）。R.oryzae在蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上，菌絲生長和產(chǎn)孢量都最大，在硫酸銨和硝酸鉀為氮源的培養(yǎng)基上菌絲生長較好，在硝酸銨為氮源的培養(yǎng)基菌絲生長較差，與無氮培養(yǎng)基差異不顯著，但在硝酸銨為氮源的培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量高于硫酸銨和硝酸鉀為氮源的培養(yǎng)基（表1）。

2.3.3培養(yǎng)條件對對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響由表2可知，兩種病原菌的菌絲生長和產(chǎn)孢的最適溫度是25℃。A.flavus和R.oryzae在pH為5-9范圍內(nèi)的PDA培養(yǎng)基上均能生長，A.flavus在pH為5、8和9的PDA培養(yǎng)基的菌絲生長速度均較快，5d后菌落直徑差異不顯著，而在pH為6時產(chǎn)孢量最大，7d后產(chǎn)孢量為9.85×106個。R.oryzae在pH為6時菌絲生長速度和產(chǎn)孢量最快，2d后菌落直徑達(dá)35.5mm，7d后產(chǎn)孢量為3.75×106個/ml：光照可促進(jìn)兩種病原菌的菌絲生長和產(chǎn)孢，A.flavus在全光照條件下生長5d后，其菌落直徑達(dá)23.0mm，而R.oryzae在全光照條件下生長2d后，菌落直徑達(dá)24.0mm，7d后產(chǎn)孢量分別達(dá)13.03×106個/ml和6.33×106個/ml。

3討論

本研究通過致病性測定、形態(tài)學(xué)特性和ITS序列分析，確定引起蘭州百合鱗莖貯藏腐爛病的病原菌是A.flavus和R.oryza，表明此腐爛病害是根霉腐爛病和曲霉腐爛病混合發(fā)生，這兩種腐爛病害在百合鱗莖腐爛的相關(guān)研究中也有報道，但與本研究中分離到的病原菌不同，其病原菌是A.niger和R.stolonifer。此外，也有較多研究表明圓弧青霉菌、簇狀青霉菌也可導(dǎo)致百合鱗莖腐爛，我們在蘭州百合鱗莖貯藏病害調(diào)查時也發(fā)現(xiàn)大多腐爛嚴(yán)重的百合鱗莖表面著生有青霉菌菌絲，而且在分離病原菌時也分離到兩種青霉菌，但致病性測定表明，這兩種青霉菌均不引起百合腐爛，僅可在刺破表皮的百合鱗莖表面繁殖，表明我們分離到兩種青霉菌僅是腐生菌，而不是病原菌。

生物學(xué)特性研究表明，A.flavus和R.oryzae兩種病原菌的最適生長條件基本相同，這可能也是兩種菌可以共生而侵染百合導(dǎo)致其發(fā)生腐爛病的原因。此外，這兩種病原菌在LA和LDA培養(yǎng)基上的菌絲生長速度和產(chǎn)孢量均高于PDA和PSA（在LA和LDA上的菌絲生長速度和產(chǎn)孢量差異不顯著），表明百合鱗莖本身的營養(yǎng)有利于這兩種菌的繁殖而侵染百合鱗莖導(dǎo)致發(fā)生腐爛病害。目前，國內(nèi)外食用百合的種植面積遠(yuǎn)低于觀賞用百合，因此對百合鱗莖腐爛病的研究大多關(guān)注觀賞用百合鱗莖種球在生長發(fā)育過程中的腐爛對出苗率和花卉品質(zhì)的影響，而尖鐮孢菌是引起觀賞用百合鱗莖種球腐爛的主要病原菌，這與導(dǎo)致蘭州百合鱗莖貯藏期間腐爛的病原菌不同，因此，防治花卉百合種球腐爛病的方法對食用百合也無借鑒作用。而作為食用的蘭州百合鱗莖在原產(chǎn)地的貯藏方式目前多采用低溫冷庫在零下4℃條件下貯藏，通常不采用其它防腐措施，導(dǎo)致貯藏期間腐爛病的發(fā)生較為嚴(yán)重，本研究通過對其病原菌的分離和生物學(xué)特性的研究，為下一步開展采用安全的方法消毒百合貯藏冷庫以及預(yù)處理百合鱗莖來防治腐爛病害的發(fā)生奠定了必要的基礎(chǔ)。

4結(jié)論

從蘭州百合腐爛鱗莖上分離鑒定得到黃曲霉和米根霉兩種病原菌。對這兩種病原菌的生物學(xué)特性研究表明,它們的最適生長條件相同，百合培養(yǎng)基和百合葡萄糖培養(yǎng)基最適宜菌絲生長和產(chǎn)孢，葡萄糖和蛋白胨為菌絲生長及產(chǎn)孢的最適碳源和氮源，最適生長溫度為25℃，在pH5-9范圍內(nèi)都可生長，光照有利于菌絲生長和產(chǎn)孢。

作者：鞏慧玲孫愛潔李茜湯國綱袁惠君馮再平李善家單位：蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院甘肅集森片裝鮮百合有限公司