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第1篇

目的： 利用簡化無血清培養(yǎng)基和連續(xù)傳代法，從成體小鼠腸管分離培養(yǎng)腸神經(jīng)嵴干細(xì)胞(GNCSCs)，觀察細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中增殖、分化的特點(diǎn). 用p75， GFAP，Peripherin，αActin作為特異性標(biāo)志來鑒定GNCSCs及其分化的細(xì)胞系. 方法： 將新生1， 5 d的小鼠腸管制成單細(xì)胞懸液，接種于無血清DMEM/F12完全培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)，連續(xù)傳代培養(yǎng)并觀察克隆球的形成過程. 將克隆球接種于含血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基中，觀察其分化現(xiàn)象. 用免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫熒光法檢測(cè)克隆球及其分化細(xì)胞系特異性標(biāo)志物的表達(dá). 結(jié)果： 成體小鼠腸管中有少數(shù)細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中存活且增殖形成克隆球. 免疫染色表明克隆球是GNCSCs并且在血清誘導(dǎo)下可分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞. 結(jié)論： 成體腸管中存在具有自我更新和多向分化能力的GNCSCs，在體外GNCSCs可分化為腸神經(jīng)系統(tǒng)所必須的細(xì)胞類型.

【關(guān)鍵詞】 腸神經(jīng)嵴干細(xì)胞 小鼠 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞分化 Hirschsprung病

0引言

應(yīng)用神經(jīng)干細(xì)胞治療某些神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和退行性疾病，經(jīng)過較長時(shí)間的實(shí)踐已被證明是行之有效的［1］. 腸神經(jīng)嵴干細(xì)胞（gut neural crest stem cells， GNCSCs）起源于神經(jīng)管背側(cè)，具有干細(xì)胞特性［2］，將其用于治療先天性巨結(jié)腸癥及腸神經(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞疾病的研究已引起人們的關(guān)注，本實(shí)驗(yàn)著重進(jìn)行GNCSCs的基礎(chǔ)研究，為臨床應(yīng)用建立理論基礎(chǔ).

1材料和方法

1.1材料新生1，5 d昆明小白鼠，15只，體質(zhì)量不拘，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供. ① DMEM/F12完全培養(yǎng)基（Gibco）組成：B27添加劑（Gibco），N2添加劑（Gibco），重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF， vitrogen)， β巰基乙醇（Sigma），青霉素和鏈霉素（華北制藥）. ② 促分化培養(yǎng)基組成：DMEM/F12完全培養(yǎng)基除bFGF外再添加100 mL/L肽牛血清. ③ 其他：胰蛋白酶、Ⅳ膠原酶（Sigma），左旋多聚賴氨酸（Sigma）. 一抗：兔抗小鼠NGFRp75（武漢博士德）、兔抗Peripherin多克隆抗體(Chemicon)，兔抗GFAP多克隆抗體（DAKO），鼠抗小鼠αActin單克隆抗體（Sigma）SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒（博士得生物工程有限公司）. 二抗為TRITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(北京中杉).

1.2方法

1.2.1取材、克隆球的培養(yǎng)頸椎脫臼法處死2組小鼠，將其腸管放入Hanks，清洗，機(jī)械分散腸管組織，胰蛋白酶和Ⅳ膠原酶分別消化腸管組織30 min，10 min，終止消化后反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液，用200目，400目的濾網(wǎng)過濾，以800 r/min 離心 5 min，棄上清，用預(yù)先配置的無血清完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，以 6×108個(gè)/L接種到25 mL培養(yǎng)瓶中，添加培養(yǎng)基至4 mL. 在37 ℃， 50 mL/ L CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中水平放置，貼壁培養(yǎng). 原代孵育24 h后棄去漂浮的死細(xì)胞，以2/3量換液，孵育3 d后進(jìn)行傳代，以6×108個(gè)/L接種到25 mL培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)孵育40~48 h后再次傳代，如有細(xì)胞團(tuán)塊形成則以1代/1~2 d的速度傳代，3代之后可形成圓形的克隆球.

1.2.2克隆球的分化用含100 mL/L胎牛血清的完全培養(yǎng)基重懸傳代5次后的克隆球，接種于放置有預(yù)先包被左旋多聚賴氨酸蓋玻片的35 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿2 mL，動(dòng)態(tài)觀察克隆球的分化情況.

1.2.3克隆球及其分化細(xì)胞特異性標(biāo)志物的染色應(yīng)用p75NTR， GFAP， Peripherin，αActin抗體分別檢測(cè)克隆球及其分化細(xì)胞系的性質(zhì)，封片后分別用光學(xué)顯微鏡和激光共焦顯微鏡取圖.

轉(zhuǎn)貼于

2結(jié)果

2.1克隆球的生長狀況接種初期，倒置顯微鏡下觀察到單細(xì)胞和一些呈半球狀或不規(guī)則的細(xì)胞團(tuán). 孵育24 h后，貼壁細(xì)胞胞呈圓形，胞體小，折光性好，部分貼壁細(xì)胞胞體增大，折光性增強(qiáng)，出現(xiàn)分裂相，形成2～5個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)，另一部分呈聚集生長. 3 d后形成十幾或數(shù)十個(gè)細(xì)胞構(gòu)成的克隆球(圖1A)，克隆球增大的同時(shí)向周圍伸出放射狀的細(xì)胞索，形成較小的次級(jí)克隆，這些克隆球形態(tài)完整，折光性減弱，周邊界線清晰，但其中心密集，界限不清，無法觀察到完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu) （圖1B）. 重新傳代培養(yǎng)，可觀察到細(xì)胞胞體增大，出現(xiàn)分裂相的克隆球數(shù)量逐漸增多，雜質(zhì)細(xì)胞減少，在連續(xù)傳代過程中克隆球逐漸純化.

2.2克隆球的分化接種含血清培養(yǎng)基12 h后，可見有細(xì)胞從克隆球中遷出，遷出的細(xì)胞貼壁生長；24 h后克隆球變扁，遷移出的細(xì)胞增多，相差顯微鏡下難以分別形態(tài)；48 h后貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯增加，逐漸形成單細(xì)胞層且細(xì)胞形態(tài)多元化.

2.3克隆球及其分化細(xì)胞系的免疫染色免疫細(xì)胞化學(xué)方法進(jìn)行p75， Peripherin， GFAP， αActin免疫染色（圖1C，圖2， 3）.

3討論

許多研究表明GNCSCs在ENS的發(fā)生和發(fā)育起關(guān)鍵作用［3-4］. 目前HSCR的病因與RET等8種基因密切相關(guān)［4-5］，在RET等基因缺失模型中， GNCSCs的生存、增殖、遷徙及分化等功能發(fā)生障礙，受累腸道的相應(yīng)神經(jīng)節(jié)出現(xiàn)缺失，表明先天性巨結(jié)腸可能是一種干細(xì)胞疾病. 由于HSCR及腸神經(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞性疾病在手術(shù)治療后仍遺留有嚴(yán)重的并發(fā)癥，因此用干細(xì)胞來進(jìn)行臨床治療已成為研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn). 鑒于胚胎干細(xì)胞的來源限制及免疫排斥問題，成體GNCSCs的研究將為今后的移植試驗(yàn)提供新契機(jī).

GNCSCs的培養(yǎng)方法建立在中樞神經(jīng)干細(xì)胞的基礎(chǔ)上. 依據(jù)神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)典的培養(yǎng)方法，再結(jié)合GNCSCs“收獲率”低、難以分離純化的特點(diǎn)，聯(lián)合應(yīng)用簡化的特殊培養(yǎng)劑和神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行體外培養(yǎng). 連續(xù)傳10代后，GNCSCs的相對(duì)比例明顯增加，這種體外培養(yǎng)的方法能有效地分離和純化GNCSCs，但并不能完全消除其他細(xì)胞. 如果繼續(xù)傳代，其純化程度越高，后續(xù)的試驗(yàn)效果將更佳. 連續(xù)傳代不僅純化了GNCSCs，還證實(shí)了干細(xì)胞的自我更新特性. 在體外培養(yǎng)干細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)條件稍有變化可導(dǎo)致分化機(jī)制的啟動(dòng)，因此采用血清促分化法誘導(dǎo)GNCSCs分化既簡單又可靠. 通過免疫染色，證實(shí)了GNCSCs分化細(xì)胞的類型，同時(shí)顯示了分化的亞型神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)，并表明了成體干細(xì)胞的多向分化能力.

參考文獻(xiàn)

［1］ 楊帆，楊樹源. 神經(jīng)干細(xì)胞研究進(jìn)展及臨床應(yīng)用前景［J］.醫(yī)學(xué)綜述， 2002；8(8):491-493.

［2］ Newgreen D， Young HM. Enteric Nervous System: development and developmental disturbancespart2［J］. Pediatr Dev Pathol，2002， 5(4): 329-349.

［3］ Natarajan D， Grigoriou M， MarcosGutierrez CV， et al. Multipotential progenitors of the mammalian enteric nervous system capable of colonizing aganglionic bowel in organ culture［J］. Development 1999， 126(1):157-168.

第2篇

關(guān)鍵詞：  大鼠 肌源性干細(xì)胞 體外培養(yǎng)

    近年研究發(fā)現(xiàn)，成體骨骼肌中不但存在單能的成肌干細(xì)胞－衛(wèi)星細(xì)胞，而且還含有多能的“肌源性干細(xì)胞”（muscle derived stem cells，MDSCs）。肌源性干細(xì)胞起源于胚胎血管祖細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)奈h(huán)境中，可分化為血細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等不同胚層的組織細(xì)胞，MDSCs的表面標(biāo)志已被初步認(rèn)識(shí)，對(duì)其分化的研究，及其分離純化的技術(shù)研究正在進(jìn)一步深入 ［1-3］。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過技術(shù)改良，通過體外原代培養(yǎng)獲得高純度MDSCs，為組織工程的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

    1  材料與方法

    1.1  材料  I型膠原酶(Sigma)， 0.25%胰蛋白酶(Hyclone)，胎牛血清(Gibco)，高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，D-Hank’ s(Gibco)，青霉素及鏈霉素(國產(chǎn))。小鼠抗大鼠Desmin一抗、羊抗小鼠FITC（異硫氰酸熒光黃）(武漢博士德)。

    1.2  原代MDSCs的取材、分離純化  參照參考文獻(xiàn)所報(bào)道的方法［4，5］ ，選用新生3～5 d的S－D乳鼠5只；浸入75%的醫(yī)用酒精中，5 min×3次，處死并消毒；無菌條件下取前肢肱三頭肌，后肢腓腸肌，盡可能剔除脂肪、肌腱等結(jié)締組織：用PBS液漂洗2次，將肌組織移入一小平皿，用眼科剪剪成乳糜狀；加入1%的Ⅰ型膠原酶3 mL，37 ℃消化30 min；加入0.25%的胰酶3 mL，37 ℃消化45 min；加入5倍體積的胎牛血清中止消化，反復(fù)吹打后濾過200目的篩網(wǎng)，收集濾液，1 000 r/ min離心7 min，室溫靜置5 min棄上層液，細(xì)胞團(tuán)塊用生長培養(yǎng)基(含20%胎牛血清的DMEM)重懸，移入培養(yǎng)瓶中，該培養(yǎng)瓶稱為PP1。PP1于37 ℃ 、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置過夜，隨后將懸液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)膠原包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，此為PP2。此后連續(xù)4 d每隔24 h將懸液離心、重懸后轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，分別為PP3～PP6。PP1～PP5棄去不用，PP6用于進(jìn)一步的鑒定實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞在達(dá)到約70%匯合時(shí)必須傳代。

    1.3  MDSCs生長曲線的繪制  取PP6傳至第2代細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，以3.0×104個(gè)／孔接種于24孔培養(yǎng)板。每日取3孔消化后，進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)，共7日根據(jù)記數(shù)結(jié)果繪制細(xì)胞生長曲線。

     2008年2月，29(1)1.4  MDSCs的免疫熒光鑒定  取PP6中的MDSCs培養(yǎng)到第3代時(shí)，把細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板中的蓋玻片上，第5 d細(xì)胞生長達(dá)70%～80%匯合，用75%乙醇固定30 min，PBS洗5 min，2次；加入5%BSA封閉液，常溫下靜置1 h，封閉非特異性結(jié)合，不清洗。滴加小鼠抗大鼠Desmin一抗，37 ℃孵育2 h；PBS洗5 min，3次；滴加羊抗小鼠FITC，避光孵育30 min；PBS洗5 min，3次；50%緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，照相。

    2  結(jié)    果

    2.1  分離細(xì)胞的形態(tài)、生長特性  PP1、PP2（圖1A）貼壁細(xì)胞相對(duì)較少，大部分是長梭形的成纖維樣細(xì)胞，其余是寬大而呈星形或不規(guī)則的雜細(xì)胞，增殖較快，1周左右即可完全融合。PP3（圖1B）開始即有少量的短梭形、圓形或多角形細(xì)胞貼壁，成纖維細(xì)胞較少。隨著純化的繼續(xù)，圓形或短梭形細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，到PP6（圖1C）時(shí)超過80%，這些細(xì)胞貼壁后絕大多數(shù)為梭形或紡錘形， 有兩極， 體積小， 胞核折光性強(qiáng)。少數(shù)細(xì)胞呈多角形， 有突起。隨培養(yǎng)時(shí)間延長，細(xì)胞增殖、遷移逐漸形成規(guī)律性的平行排列。極易融合，生長呈方向性，若不加以控制及時(shí)傳代，細(xì)胞可迅速融合成細(xì)胞鏈或聚成團(tuán)塊生長，細(xì)胞增殖速度減慢， 細(xì)胞相互融合， 形成肌小管（圖1D）。圖1A  PP1、PP2貼壁細(xì)胞相對(duì)較少，大部分是長梭形的成纖維樣細(xì)胞和寬大而呈星形或不規(guī)則的雜細(xì)胞×200 

    圖1B  PP3有少量的短梭形、圓形或多角形細(xì)胞貼壁，成纖維細(xì)胞較少×200

    圖1C  PP6圓形或短梭形細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，超過80% ×200

    圖1D  細(xì)胞增殖、遷移逐漸形成規(guī)律性的平行排列。極易融合，生長呈方向性，細(xì)胞增殖速度減慢，×200

    圖1E、F  細(xì)胞特異性desmin染色呈陽性，熒光顯微鏡可見細(xì)胞發(fā)出綠色熒光×400

    2.2  生長曲線  第2日開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，第5日后由于接觸抑制，增殖速度減慢(圖2)。圖2  傳代MDSCs的生長曲線

    2.3  對(duì)PP6的細(xì)胞表型鑒定  肌源性干細(xì)胞本身具有特征性的外形， 其胞漿中含有結(jié)蛋白(desmin) 可通過細(xì)胞免疫熒光方法鑒定。本實(shí)驗(yàn)采用小鼠抗大鼠desmin一抗對(duì)肌源性干細(xì)胞進(jìn)行鑒定，細(xì)胞質(zhì)desmin染色陽性（圖1E，1F），細(xì)胞胞質(zhì)呈現(xiàn)綠色熒光。觀察500個(gè)細(xì)胞，90%為desmin陽性。

3  討    論

第3篇

【關(guān)鍵詞】 大鼠 肌源性干細(xì)胞 體外培養(yǎng)

Abstract：Objective To establish the methods for culture and identification of rat muscle-derived stem cells in vitro.Methods

By two-step method， the rat muscle was digested with type I collagen and trypsin， and the isolated cell suspension was purified by different adhesion time . The proliferation ability of muscle-derived stem cells was analysed through studying growth curve， and the obtained cells were identified with cell immunofluroescence technique．Results Highly purified MDSCs were harvested and they showed desmin(+) by cell immunofluroescence technique．Conclusions

MDSCs can be cultured in vitro and can be identified by desmin stain and used to tissue engineering as “seed”cells.

Key words：rat ; muscle derived stem cells ; culture in vitro

近年研究發(fā)現(xiàn)，成體骨骼肌中不但存在單能的成肌干細(xì)胞－衛(wèi)星細(xì)胞，而且還含有多能的“肌源性干細(xì)胞”（muscle derived stem cells，MDSCs）。肌源性干細(xì)胞起源于胚胎血管祖細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)奈h(huán)境中，可分化為血細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等不同胚層的組織細(xì)胞，MDSCs的表面標(biāo)志已被初步認(rèn)識(shí)，對(duì)其分化的研究，及其分離純化的技術(shù)研究正在進(jìn)一步深入 ［1-3］。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過技術(shù)改良，通過體外原代培養(yǎng)獲得高純度MDSCs，為組織工程的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 I型膠原酶(Sigma)， 0.25%胰蛋白酶(Hyclone)，胎牛血清(Gibco)，高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，D-Hank’ s(Gibco)，青霉素及鏈霉素(國產(chǎn))。小鼠抗大鼠Desmin一抗、羊抗小鼠FITC（異硫氰酸熒光黃）(武漢博士德)。

1.2 原代MDSCs的取材、分離純化 參照參考文獻(xiàn)所報(bào)道的方法［4，5］ ，選用新生3～5 d的S－D乳鼠5只；浸入75%的醫(yī)用酒精中，5 min×3次，處死并消毒；無菌條件下取前肢肱三頭肌，后肢腓腸肌，盡可能剔除脂肪、肌腱等結(jié)締組織：用PBS液漂洗2次，將肌組織移入一小平皿，用眼科剪剪成乳糜狀；加入1%的Ⅰ型膠原酶3 mL，37 ℃消化30 min；加入0.25%的胰酶3 mL，37 ℃消化45 min；加入5倍體積的胎牛血清中止消化，反復(fù)吹打后濾過200目的篩網(wǎng)，收集濾液，1 000 r/ min離心7 min，室溫靜置5 min棄上層液，細(xì)胞團(tuán)塊用生長培養(yǎng)基(含20%胎牛血清的DMEM)重懸，移入培養(yǎng)瓶中，該培養(yǎng)瓶稱為PP1。PP1于37 ℃ 、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置過夜，隨后將懸液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)膠原包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，此為PP2。此后連續(xù)4 d每隔24 h將懸液離心、重懸后轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，分別為PP3～PP6。PP1～PP5棄去不用，PP6用于進(jìn)一步的鑒定實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞在達(dá)到約70%匯合時(shí)必須傳代。

1.3 MDSCs生長曲線的繪制 取PP6傳至第2代細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，以3.0×104個(gè)／孔接種于24孔培養(yǎng)板。每日取3孔消化后，進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)，共7日根據(jù)記數(shù)結(jié)果繪制細(xì)胞生長曲線。

2008年2月，29(1)1.4 MDSCs的免疫熒光鑒定 取PP6中的MDSCs培養(yǎng)到第3代時(shí)，把細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板中的蓋玻片上，第5 d細(xì)胞生長達(dá)70%～80%匯合，用75%乙醇固定30 min，PBS洗5 min，2次；加入5%BSA封閉液，常溫下靜置1 h，封閉非特異性結(jié)合，不清洗。滴加小鼠抗大鼠Desmin一抗，37 ℃孵育2 h；PBS洗5 min，3次；滴加羊抗小鼠FITC，避光孵育30 min；PBS洗5 min，3次；50%緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，照相。

2 結(jié)

果

2.1 分離細(xì)胞的形態(tài)、生長特性 PP1、PP2（圖1A）貼壁細(xì)胞相對(duì)較少，大部分是長梭形的成纖維樣細(xì)胞，其余是寬大而呈星形或不規(guī)則的雜細(xì)胞，增殖較快，1周左右即可完全融合。PP3（圖1B）開始即有少量的短梭形、圓形或多角形細(xì)胞貼壁，成纖維細(xì)胞較少。隨著純化的繼續(xù)，圓形或短梭形細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，到PP6（圖1C）時(shí)超過80%，這些細(xì)胞貼壁后絕大多數(shù)為梭形或紡錘形， 有兩極， 體積小， 胞核折光性強(qiáng)。少數(shù)細(xì)胞呈多角形， 有突起。隨培養(yǎng)時(shí)間延長，細(xì)胞增殖、遷移逐漸形成規(guī)律性的平行排列。極易融合，生長呈方向性，若不加以控制及時(shí)傳代，細(xì)胞可迅速融合成細(xì)胞鏈或聚成團(tuán)塊生長，細(xì)胞增殖速度減慢， 細(xì)胞相互融合， 形成肌小管（圖1D）。圖1A PP1、PP2貼壁細(xì)胞相對(duì)較少，大部分是長梭形的成纖維樣細(xì)胞和寬大而呈星形或不規(guī)則的雜細(xì)胞×200

圖1B PP3有少量的短梭形、圓形或多角形細(xì)胞貼壁，成纖維細(xì)胞較少×200

圖1C PP6圓形或短梭形細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，超過80% ×200

圖1D 細(xì)胞增殖、遷移逐漸形成規(guī)律性的平行排列。極易融合，生長呈方向性，細(xì)胞增殖速度減慢，×200

圖1E、F 細(xì)胞特異性desmin染色呈陽性，熒光顯微鏡可見細(xì)胞發(fā)出綠色熒光×400

2.2 生長曲線 第2日開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，第5日后由于接觸抑制，增殖速度減慢(圖2)。圖2 傳代MDSCs的生長曲線

2.3 對(duì)PP6的細(xì)胞表型鑒定 肌源性干細(xì)胞本身具有特征性的外形， 其胞漿中含有結(jié)蛋白(desmin) 可通過細(xì)胞免疫熒光方法鑒定。本實(shí)驗(yàn)采用小鼠抗大鼠desmin一抗對(duì)肌源性干細(xì)胞進(jìn)行鑒定，細(xì)胞質(zhì)desmin染色陽性（圖1E，1F），細(xì)胞胞質(zhì)呈現(xiàn)綠色熒光。觀察500個(gè)細(xì)胞，90%為desmin陽性。

3 討

論

近年在骨骼肌中發(fā)現(xiàn)了一群被稱為MDSCs的細(xì)胞群體。預(yù)期它們?cè)诮M織工程應(yīng)用領(lǐng)域特別是細(xì)胞移植和基因治療方面前景廣闊。國外已在進(jìn)行大量MDSCs介導(dǎo)的相關(guān)的基因治療和組織工程的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［6-8］，并取得了較明顯的效果。因此建立和完善MDSCs培養(yǎng)方法，獲取高純度的細(xì)胞具有重要實(shí)用價(jià)值。

骨骼肌細(xì)胞是由胚胎的生肌節(jié)和各處的間充質(zhì)細(xì)胞分化而成，在肌膜和基膜之間有一種體積較小的扁平成立方形細(xì)胞，稱為衛(wèi)星細(xì)胞［9］，是保留在成年骨骼肌內(nèi)具有增殖分化能力的單潛能成肌干細(xì)胞，這種組織特異性的干細(xì)胞在出生后骨骼肌的損傷、修復(fù)和維持中起重要作用。有證據(jù)表明新近發(fā)現(xiàn)的肌源性干細(xì)胞(MDSCs)是一群與衛(wèi)星細(xì)胞完全不同的細(xì)胞群。可能是一群未向任何方向定型的原始干細(xì)胞。

lee等［7］31-37從骨骼肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了MDSCs，與衛(wèi)星細(xì)胞相比，其具有更多的分化潛能，不僅能分化成骨骼肌纖維，促進(jìn)肌組織再生，還能分化成成骨細(xì)胞，促進(jìn)骨骼愈合［5］，被認(rèn)為是衛(wèi)星細(xì)胞的前體。貼壁前的MDSCs呈小而圓的球形，折光性強(qiáng)，剛貼壁仍為圓形，貼壁后的MDSCs呈紡錘形，延遲分瓶時(shí)會(huì)融合成成熟的多核肌管，這與成纖維細(xì)胞不同。preplate技術(shù)利用差速貼壁獲取MDSCs，其原理是成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的貼壁能力強(qiáng)于衛(wèi)星細(xì)胞，衛(wèi)星細(xì)胞的貼附能力又強(qiáng)于MDSCs，4 d內(nèi)即可完全貼壁而此時(shí)MDSCs仍處于懸浮狀態(tài)［6］1085-1100，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，組織塊中加入膠原酶后很快就變成了乳糜狀，胰酶對(duì)組織具有很好的離散作用，再通過反復(fù)吹打可將細(xì)胞從基膜中分離出來，得到的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞、白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、衛(wèi)星細(xì)胞及MDSCs的混合物，利用差速貼壁法4 d后處于懸浮狀態(tài)的細(xì)胞移出培養(yǎng)即為純化的MDSCs。MDSCs本身具有特征性外形，我們通過結(jié)蛋白desmin染色鑒定其肌源性，通過其多向分化的能力來鑒定其干細(xì)胞特性。實(shí)驗(yàn)中我們還發(fā)現(xiàn)，隨著乳鼠出生天數(shù)的延長，所取得的MDSCs的數(shù)量和活力逐漸下降，但出生時(shí)間太短，活力太差，又不利于取材。新出生3～5 d的大鼠最適宜進(jìn)行原代取材。

結(jié)蛋白（desmin）是中間絲蛋白的一種，是成肌分化的早期的標(biāo)志，常作為肌源性的標(biāo)志，雖然成纖維細(xì)胞與骨骼肌內(nèi)血管平滑肌細(xì)胞也產(chǎn)生結(jié)蛋白，但此細(xì)胞中結(jié)蛋白含量低，與抗體產(chǎn)生弱陽性反應(yīng)，且僅有15％的desmin陽性率［10］，而通過本方法獲取的MDSCs中desmin陽性率高達(dá)90%，由此可進(jìn)行初步鑒別。

MDSCs屬于成體干細(xì)胞，具有取材方便、免疫原性低、移植后存活時(shí)間長等優(yōu)點(diǎn)，在組織工程和基因治療中具有廣泛的應(yīng)用前景。通過對(duì)常規(guī)技術(shù)的改良，本研究建立了一種穩(wěn)定高效的新生大鼠MDSCs分離純化技術(shù)，并成功對(duì)MDSCs進(jìn)行了鑒定，為MDSCs在基因治療和組織工程的臨床應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。

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