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第1篇

[關(guān)鍵詞] 病毒滅活血漿；新鮮冰凍血漿；血漿置換；效果

[中圖分類號] R457.1+4 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2013）05（b）-0062-02

亞甲藍(lán)光化學(xué)（MB）法滅活血漿中的病毒是一種最安全、有效的適合于臨床用單袋血漿病毒滅活的方法，其滅活效果已被大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)[1-2]，輸注病毒滅活血漿成為當(dāng)前國內(nèi)外預(yù)防輸注血漿制品傳播傳染病的有效措施，MB法病毒滅活血漿技術(shù)，已被推廣應(yīng)用于全國部分血站。對于MB法病毒滅活血漿后，對于血漿內(nèi)有效成分的影響國內(nèi)各家血站報道不一，但是都一致顯示MB法病毒滅活后的血漿有效成分有所改變[3-4]。但是這些或多或少的改變是否影響臨床應(yīng)用效果，尤其是在血漿置換中大量應(yīng)用血漿時是否有影響，國內(nèi)目前尚無報道。筆者對此情況進(jìn)行了研究，具體如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

2012年1～6月隨機(jī)采用庫存新鮮冰凍血漿。無償獻(xiàn)血者的血液（400 mL/袋），于采集后6 h內(nèi)分離制備的新鮮血漿（5000 g/min，10 min，4℃），按照操作規(guī)程制備成新鮮冰凍血漿（200 mL/袋）。在凈化間將血漿與一次性病毒滅活輸血過濾器相連。向血漿中加入亞甲藍(lán)，混勻后使亞甲藍(lán)的濃度為1 μg/mL，并在31800LX強(qiáng)度的光照下4℃搖動照射30 min，然后把經(jīng)光照后的血漿通過一次性血漿滅活血袋的濾器濾除亞甲藍(lán)，制備成病毒滅活血漿。

同期選擇在洛陽市所進(jìn)行的血漿置換患者26例，其中重癥肝病患者19例，有機(jī)磷農(nóng)藥中毒7例，患者年齡在15～50歲，中位年齡31歲，其中，男性17例，女性9例，以上病例在血漿置換中12例置換液采用新鮮冰凍血漿，采用病毒滅活血漿14例。

1.2 方法

光照病毒滅活：（1）采用中保康醫(yī)療器具有限公司生產(chǎn)的ZBK-YBM-01型醫(yī)用血槳病毒滅活柜，操作按說明書；（2）采用上海輸血技術(shù)有限公司生產(chǎn)的HDME-1醫(yī)用血漿病毒滅活柜，操作按說明書。

血漿置換法：采用美國血液技術(shù)公司生產(chǎn)的MCS+型血細(xì)胞分離機(jī)，選擇血漿置換程序及TPE規(guī)程卡、980E耗材，置換液采用新鮮冰凍血漿或病毒滅活血漿。

主要儀器：SORVAL 3BP離心機(jī)（美國Thermo 公司），ZBK-YBM-01型醫(yī)用血漿病毒滅活柜及耗材（淄博中保康醫(yī)療器具有限公司），MCS+型血細(xì)胞分離機(jī)及耗材（美國血液技術(shù)公司生產(chǎn)），奧林巴斯全自動生化分析儀。

1.3 觀察指標(biāo)

血漿凝血因子活性側(cè)定：應(yīng)用國際通用的一期法檢測血漿。血漿清蛋白測定： 用雙縮脈法檢測血漿總蛋白。

1.4 統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS 12.0分析軟件，分析應(yīng)用新鮮冰凍血漿和病毒滅活血漿血漿置換兩組間的凝血時間、血漿蛋白比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不同血漿置換前后患者凝血因子比較

應(yīng)用新鮮冰凍血漿、病毒滅活血漿進(jìn)行血漿置換治療后，凝血因子結(jié)果見表1。結(jié)果顯示應(yīng)用病毒滅活血漿組治療后患者PT、APTT與治療前比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。

2.2 不同血漿置換前后患者血漿蛋白比較

應(yīng)用新鮮冰凍血漿、病毒滅活血漿血漿置換治療后，血漿蛋白結(jié)果表2。結(jié)果顯示兩組治療前后清蛋白檢測差異無統(tǒng)計學(xué)意（P > 0.05）。

3 討論

血漿是可發(fā)生經(jīng)輸血傳播疾病的主要血液成分之一，近幾年的用量持續(xù)增加，因此在保證血漿臨床輸用安全的同時，提高血漿質(zhì)量和應(yīng)用效果是非常重要的。病毒滅活作為一種降低輸血風(fēng)險的新技術(shù)，除應(yīng)能有效地滅活血液成分中可能存在的病毒外，更重要的是對血液成分的功能應(yīng)無顯著性影響，保證血液成分的足夠療效。MB光化學(xué)法是近年發(fā)展起來的新技術(shù)[5-6]。光化學(xué)法滅活病毒的機(jī)制主要是依靠光敏劑在光照射下，產(chǎn)生自由基（一類機(jī)制）或單線態(tài)氧（二類機(jī)制）氧化損傷病毒的分子結(jié)構(gòu)，從而殺滅病毒，由于目前全國各地血站供臨床使用的血漿均為單人份血漿，其可能內(nèi)含的脂質(zhì)包膜病毒，對人體健康有危害，為了克服此危害，必須對脂質(zhì)包膜病毒滅活。大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，用亞甲藍(lán)光化學(xué)處理血漿可完全滅活血漿內(nèi)所含的VSV和Sindbis病毒（這2種病毒是國內(nèi)外公認(rèn)的血液制品病毒滅活有效性的指示病毒，其中VSV是HIV的模型病毒，Sindbis是HCV的模型病毒，均為RNA脂質(zhì)包膜病毒），病毒滴度明顯下降。同時保證血漿主要凝血因子（Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ）的回收率>80%，白、球蛋白的回收率>90%。血漿蛋白的免疫原性無變化，總蛋白損失輕微[7]。

血漿置換因患者病情需幾乎置換出患者體內(nèi)原有血漿，本研究旨在研究大量應(yīng)用病毒滅活冰凍血漿后患者體內(nèi)的凝血狀態(tài)以及血清蛋白的變化。研究結(jié)果表明，大量的新鮮冰凍血漿應(yīng)用后患者體內(nèi)的凝血狀態(tài)以及血清蛋白均無明顯變化，但是病毒滅活冰凍血漿應(yīng)用后，患者體內(nèi)凝PT、APTT均有所延長，但是延長均在正常范圍內(nèi)，說明病毒滅活冰凍血漿應(yīng)用量較大時可以影響患者體內(nèi)凝血。凝血因子絕大多數(shù)在肝臟合成，肝實(shí)質(zhì)損傷可導(dǎo)致凝血因子的合成減少，表現(xiàn)為凝血酶原（PT）延長，患者有出血傾向。因此肝病患者在血漿置換過程中，推薦使用新鮮冰凍血漿（FFP）做置換液，臨床效果更佳。筆者在多例臨床血漿置換術(shù)應(yīng)用當(dāng)中，根據(jù)不同患者、不同病情使用不同血漿（新鮮冰凍血漿、病毒滅活血漿），均獲得良好療效。

有研究表明雖然過濾前后FⅧ和FⅨ因子活性幾乎無改變，但是對因子影響最大的是滅活過程[8]。經(jīng)過MB光化學(xué)法對血漿進(jìn)行病毒滅活處理后，血漿中的FⅨ因子滅活前后變化不大，F(xiàn)Ⅷ因子水平下降，但活性水平仍大于75%，仍在國家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)允許范圍內(nèi)，雖然對因子有一定的損傷作用，但結(jié)合其滅活性能，MB光化學(xué)病毒滅活工藝對單人份血漿的病毒滅活還是一種比較有效的方法，其對臨床輸血安全性具有重要意義。臨床在應(yīng)用病毒滅活血漿時，可以適當(dāng)增加用量，保證治療效果，如將原來10～15 mL/kg的應(yīng)用劑量增加25%用量，提高至13～19 mL/kg[2]。

要從根本上控制和杜絕血源性的傳染病，除加強(qiáng)篩查以外，還必須對血液進(jìn)行滅活病毒處理，才能達(dá)到輸血安全的目的。血液成分的病毒滅活是實(shí)現(xiàn)安全輸血的唯一途徑。尤其在進(jìn)行血漿置換術(shù)中，大量應(yīng)用血漿制品時，病毒滅活血漿安全性仍較高。

[參考文獻(xiàn)]

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第2篇

【關(guān)鍵詞】病毒滅活冰凍血漿;凝血因子;因子活性;血漿蛋白

The discussion of virus inactivated frozen plasma and fresh frozen plasma part of effective ingredients of quality changesPAN Guoxiong,XIE Zhongxing,LI Shuying.Clinical Laboratory,Guangdong Zhaoqing second Poeple’s Hospital,Zhaoqing 526060,China

【Abstract】ObjectiveTo explore virus inactivated frozen plasma and fresh frozen plasma part of effective ingredients of quality changes MethodsTo gather 50 bags fresh plasma, A and B is divided into two groups, detected PT，TT，APTT，F(xiàn)g，TP,ALB,FⅧ,FⅤ respectivelyResultsThe content of TP, FⅧ, FⅤ and Fg in virus inactivated frozen plasma with a certain degree of reduced, but mostly within 30%, in the acceptable rangeConclusionThe MB virus inactivated plasma did not influence the clinical application, it did More good than harm .

【Key words】Virus inactivated frozen plasma;Clotting factor;Factor activity；Plasma protein

新鮮冰凍血漿內(nèi)含有各種凝血因子及各種血漿蛋白，由于血漿及其制品的病毒檢測方法有一定的局限性及病毒“窗

作者單位：526060廣東省肇慶市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科

口期”的存在，新鮮冰凍血漿和全血一樣，具有傳播艾滋病、乙型肝炎等輸血傳播疾病的危險［1］，因此輸血的危險性依然存在。為使廣大患者能更安全有效地使用血漿，我?guī)堁緦?/p>

血漿開展了亞甲藍(lán)(MB)光化學(xué)法病毒滅活項(xiàng)目。MB光化學(xué)法病毒滅活技術(shù)應(yīng)用于血漿病毒的滅活，其有效性和安全性已被證實(shí)，但MB光化學(xué)法病毒滅活的過程對新鮮血漿中的凝血因子及血漿蛋白等有效成分的質(zhì)量會產(chǎn)生怎樣的變化，仍有待確認(rèn)。為此我們通過實(shí)驗(yàn)檢測血漿中的部分有效成份的變化并作一分析探討。

1材料與方法

11樣本來源隨機(jī)抽取50份常規(guī)血液，按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程制備新鮮血漿。每人份一分為二，分兩組，A組為不滅活病毒新鮮血漿，立即進(jìn)行檢測。另一組為B組，進(jìn)行MB光化學(xué)法病毒滅活后的新鮮冰凍血漿從采集到制備完畢6 h內(nèi)進(jìn)行檢測。

12材料一次性無菌試管，德國BE1500自動血凝分析儀，CL800生化分析儀。嚴(yán)格按照儀器與試劑操作說明的要求進(jìn)行檢測。

13資料①PT (凝血酶原時間)用于外源性凝血因子(Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅰ)凝血功能的篩查。②APTT(活性部分凝血酶原時間)用于檢測內(nèi)源性凝血因子(Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ)凝血功能。③TT(凝血酶時間)，快速評定止血和血栓形成的有效方法。④Fg(纖維蛋白原)。檢測PT，TT，APTT，F(xiàn)g能間接反映血漿中的因子活性水平。

血漿蛋白的測定；①TP(總蛋白)。②ALB(白蛋白)

14方法A組為新鮮冰凍血漿，不滅活直接進(jìn)行測定，B組為滅活冰凍血漿，先對其進(jìn)行MB(亞甲藍(lán))光化學(xué)病毒滅活后再測定。在血漿進(jìn)行病毒滅活后進(jìn)行熱封口時留樣檢驗(yàn)。

15統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 160作t檢驗(yàn)分析。

2結(jié)果

21兩種血漿實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果(見表1)。

表1兩種血漿各指標(biāo)均值的實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果

名稱

(單位)允許正

常范圍新鮮冰

凍血漿MB病毒

滅活血漿PT(s)9～14313201520TT(s)8～1513401660APTT(s)21～44538815212Fg(g/L)2～4260151TP(g/L)60～8070026360ALB(g/L)35～5044224011FⅤ(%)70～15098406890FⅧ(%)70～15010820778022各項(xiàng)指標(biāo)的統(tǒng)計結(jié)果比較(見表2，3)。

表2MB滅活血漿各項(xiàng)指標(biāo)與正常范圍比較的可信區(qū)間

第3篇

作者：胡嘉淼 單位：暨南大學(xué)生物工程學(xué)系

菌株前處理將活化的大腸桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心收集菌體(4000r/min，10min)，棄上清，懸浮菌體于PBS，使得OD600=0．05(108CFU/ml左右)。不同濃度的亞甲基藍(lán)對PBS和牛奶中大腸桿菌的滅活作用的測定將備制好的含大腸桿菌的菌懸液10μl和含1%脫脂奶粉的牛奶190μl加入96孔板中，每孔共200μl，并在各孔中加入MB，使其終濃度分別為0．5×10－2、0．5×10－1、0．2、0．5、1.0、2.0、5.0和10.0μg/ml，37℃避光孵育30min，放在距離溴鎢燈光源20cm處(測得光強(qiáng)度為160mw)照射10min后進(jìn)行平板計數(shù)(L+S+)。同時設(shè)置不光照和/或不加MB組作為對照(L-S-;L+S-;L-S+)。不同光照時間對PBS和牛奶中大腸桿菌的滅活作用的測定按照“1．2”方法處理大腸桿菌后，在96孔板中加入10μl菌懸液和190μl含1%脫脂奶粉的牛奶，并在各孔中加入MB，使其終濃度為2μg/ml，37℃避光孵育30min后在距離溴鎢燈光源20cm處照射1、5、10、15、20和30min后進(jìn)行平板計數(shù)(L+S+)。同時設(shè)置不光照和/或不加MB組作為對照(L-S-;L+S-;L-S+)。不同牛奶濃度對亞甲基藍(lán)/光化學(xué)法滅活大腸桿菌效率的影響將含1.0%、2．5%、5.0%和10.0%脫脂奶粉的菌懸液加入96孔板中，每孔200μl(190μl牛奶+10μl菌懸液)，并在各孔中加入MB，使其終濃度分別為1、2、5和10μg/ml，37℃避光孵育30min，放在距離溴鎢燈光源20cm處照射10min后進(jìn)行平板計數(shù)(L+S+)。同時設(shè)置加MB但不光照的空白組作為對照(L-S+)。細(xì)菌菌落平板計數(shù)將上述不同處理方式所得的菌懸液均以1∶10梯度稀釋后涂板于細(xì)菌計數(shù)培養(yǎng)基平板上，于37℃生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，24h后取出進(jìn)行菌落計數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。數(shù)據(jù)處理結(jié)果以均數(shù)(x珋)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，用GraphPadPrism5所帶的統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。差異顯著性采用t檢驗(yàn)，P＜0．05為顯著差異。

亞甲基藍(lán)/光化學(xué)法處理前后細(xì)菌形態(tài)對照相較于未添加光敏劑、未光照的空白對照組(圖1－A)，經(jīng)過2μg/ml的亞甲基藍(lán)，10min的溴鎢燈光源照射處理后的牛奶中的大腸桿菌(圖1－B)置于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，可以看到試驗(yàn)組中菌落很小，透明，呈灰色，邊緣整齊，呈滴露狀;而空白對照組則菌落較大，菌落不透明，呈乳白色。不同濃度亞甲基藍(lán)對亞甲基藍(lán)/光化學(xué)法滅活PBS和牛奶中大腸桿菌效果的影響由圖2和圖3可知，隨著光敏劑MB濃度的增加，亞甲基藍(lán)/光化學(xué)法對大腸桿菌的殺傷作用逐漸增強(qiáng)。當(dāng)MB濃度低至0．5×10－2μg/ml，光照10min即可使PBS中約80%的大腸桿菌失活;當(dāng)MB濃度達(dá)到0．2μg/ml時，幾乎可完全使PBS中的大腸桿菌滅活。而在同樣光照時間下，要致死牛奶中70%的大腸桿菌，則需MB濃度為0．5×10－1μg/ml;而當(dāng)MB濃度為5.0μg/ml時，則可使牛奶中大腸桿菌菌落總數(shù)降低7個數(shù)量級。同時對照組則未顯示出明顯的殺傷作用。由此可見，亞甲基藍(lán)/光化學(xué)法對PBS和牛奶中的大腸桿菌有較好的殺傷作用。2．3不同光照時間對亞甲基藍(lán)/光化學(xué)法滅活PBS和牛奶中大腸桿菌效果的影響由圖4和圖5可知，當(dāng)MB濃度在2.0μg/ml時，光照時間在一定范圍內(nèi)的延長對大腸桿菌細(xì)菌滅活作用的有一定程度的提高。當(dāng)MB在一定濃度下，光照時間≥10min情況下，亞甲基藍(lán)/光化學(xué)法能使PBS中的大腸桿菌菌落總數(shù)顯著降低6個數(shù)量級以上，即殺傷99.999%的大腸桿菌;而在同樣的光照時間下，牛奶中大腸桿菌的滅活效果比PBS中的滅活效果稍顯遜色，仍能降低4個數(shù)量級以上，滅活率達(dá)到99．99%，而光照延長至15min以上時，牛奶中大腸桿菌的滅活效果則可同樣達(dá)到6個數(shù)量級2．4不同牛奶濃度對亞甲基藍(lán)/光化學(xué)法滅活模擬體系中大腸桿菌效果的影響由圖6可知，隨著牛奶濃度的升高，亞甲基藍(lán)/光化學(xué)法對大腸桿菌的滅活效果逐漸減弱，當(dāng)經(jīng)過MB濃度為5μg/ml的光化學(xué)法處理10min后，1%牛奶含量的模擬體系中的大腸桿菌降低7．5個數(shù)量級，而10%的體系僅降低2個數(shù)量級，這可能是由于溶液光通透性的降低影響了亞甲基藍(lán)/光化學(xué)法的滅菌效果。

通過試驗(yàn)可知亞甲基藍(lán)/光化學(xué)法作為一種新型滅菌技術(shù)對模擬受感染牛奶中的大腸桿菌有明顯的殺傷作用，當(dāng)亞甲基藍(lán)濃度為2.0μg/ml，接受光功密度為200mW/cm2的溴鎢燈光照10min能殺死99%以上的大腸桿菌，而對照組未見明顯的殺傷作用。并且筆者觀察到經(jīng)過亞甲基藍(lán)/光化學(xué)法處理過的大腸桿菌在固體培養(yǎng)基上生長形態(tài)也發(fā)生了明顯的改變，說明亞甲基藍(lán)/光化學(xué)法處理可以有效地影響大腸桿菌的正常生長。同時，還發(fā)現(xiàn)亞甲基藍(lán)/光化學(xué)法對模擬受感染牛奶中大腸桿菌的滅活效果略低于PBS對照組中的大腸桿菌，這可能是與牛奶相比，PBS的光通透性有所降低有直接的關(guān)系。這一猜想在后續(xù)試驗(yàn)中得到證實(shí):隨著牛奶濃度的增高，即溶液的光通透性的不斷降低，體系中大腸桿菌的滅活效果隨之下降，與前人運(yùn)用亞甲基藍(lán)/光化學(xué)法滅活血漿中病毒［8］，由于全血中紅細(xì)胞等固體成分較多，導(dǎo)致滅活病毒有所降低的試驗(yàn)結(jié)果及推論相符。此外還發(fā)現(xiàn)，通過適當(dāng)延長光照時間，或適量增加光敏劑濃度，仍然可以快速高效地滅活牛奶中的大腸桿菌。該次試驗(yàn)結(jié)果表明，亞甲基藍(lán)/光化學(xué)法對牛奶等液體中的大腸桿菌的滅活效果顯著。目前工業(yè)上常使用巴氏殺菌、超高溫瞬時滅菌等熱力殺菌方法來保障牛奶的質(zhì)量安全，這些熱力殺菌方式雖然能保證牛奶在微生物方面的安全，但能量消耗較大，對牛奶的品質(zhì)破壞也較大，易造成熱敏性營養(yǎng)成分損失、揮發(fā)性物質(zhì)散失、風(fēng)味變化、水分流失等，并且對于多種致病微生物所產(chǎn)生的致病毒素等危害產(chǎn)物無法有效去除。而由于光敏劑具有選擇性地聚集在有害微生物及其生物膜的特性，能夠有效滅活牛奶中的有害微生物［11］，因此PDT相對于傳統(tǒng)的殺菌方法，將是一種值得開發(fā)的，安全、簡便、高效，非常有前景的新型非熱滅菌方法，具備良好的應(yīng)用前景。