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《供水技術(shù)雜志》2016年第5期

摘要:

氯霉素藥物在水產(chǎn)及畜牧業(yè)使用廣泛，相關(guān)的行業(yè)用水及抗生素生產(chǎn)廢水會(huì)在水域中殘留，若被人體長(zhǎng)期攝取，會(huì)造成被動(dòng)的抗生素濫用，嚴(yán)重影響民眾身體健康水平，因此水中氯霉素的檢測(cè)需要引起重視。開發(fā)了一種針對(duì)水樣品中氯霉素的快速檢測(cè)方法。通過(guò)比較確定氮吹法為最優(yōu)的前處理方法，并得到了較高的檢測(cè)靈敏度(25ng/L)。本研究為ELISA法在水質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用提供了一個(gè)范例，給水源污染應(yīng)急檢測(cè)提供一個(gè)快速檢測(cè)方案。

關(guān)鍵詞:

酶聯(lián)免疫法;氯霉素;凍干;氮吹

酶聯(lián)免疫法自1971年建立以來(lái)，由于其極高的靈敏度、特異性及適用性，已成為生物及分析化學(xué)領(lǐng)域的前沿課題［1］。目前此法在醫(yī)學(xué)、檢測(cè)食品藥物殘留方面有廣泛成熟的應(yīng)用，而在水質(zhì)檢測(cè)中報(bào)導(dǎo)較少。形成這種情況的重要原因之一是ELISA研發(fā)過(guò)程中的樣品處理方式不適用于水質(zhì)樣本檢測(cè)。氯霉素屬?gòu)V譜類抗生素藥物，能抑制尤其是革蘭氏陰性菌細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，對(duì)各種立克氏體、原蟲及部分病毒也有一定的抑制作用［2］。目前氯霉素類藥物在水產(chǎn)和畜禽養(yǎng)殖中仍應(yīng)用廣泛，添加氯霉素的水產(chǎn)養(yǎng)殖水和抗生素制藥廠偷排的廢水是環(huán)境中氯霉素的來(lái)源。因此氯霉素的環(huán)境污染，尤其是水域中的污染是值得重視的問(wèn)題［3］。目前檢測(cè)氯霉素方法包括高效液相色譜法［4－5］、氣相色譜法［6］、質(zhì)譜法［7－9］等，其分析時(shí)間長(zhǎng)、樣品前處理復(fù)雜、需要昂貴的儀器且對(duì)操作人員技能有很高的要求。本文將探索酶聯(lián)免疫法如何與適合的樣品前處理技術(shù)結(jié)合，以氯霉素(Chloramphenicol)為目標(biāo)物，測(cè)定水中的氯霉素含量。而ELISA方法不但有極高的特異性、準(zhǔn)確度和靈敏度，還具有檢測(cè)速度快、同時(shí)檢測(cè)大量樣本、方便易用的特點(diǎn)。

1材料與方法

1.1試劑和儀器

試劑:氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液100μg/mL(甲醇溶劑，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心)、乙腈(色譜純)、乙酸乙酯(色譜純)、甲醇(色譜純)，Milli－P超純水，氯霉素檢測(cè)試劑盒(深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司)。儀器:ThermoMultiskanFC96孔酶標(biāo)儀(配備450和630nm濾光片);Eppendorf5702離心機(jī)(轉(zhuǎn)速4000r/min);DenverInstrument天平(感量0．00001g);IKAMS3basic渦旋儀;氮?dú)獯蹈蓛x;Thermofinnpippete移液器:單道10～100μL、100～1000μL、多道30～300μL。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1準(zhǔn)備

使用試劑盒前將試劑和微孔板回溫至室溫，用后放回2～8℃。取出需要數(shù)量的微孔板，其余的放入自封袋中，保存于2～8℃。建議每個(gè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)液做2次平行試驗(yàn)。

1.2.2加樣

加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣品50μL到相應(yīng)微孔，然后加入酶結(jié)合物50μL到每個(gè)微孔，最后加入抗體工作液50μL到每孔，輕輕震蕩混勻后，蓋上蓋板膜。

1.2.3孵育

室溫25℃下避光反應(yīng)30min。

1.2.4洗板

小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，加1×洗滌液250μL/孔，重復(fù)洗滌5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干。

1.2.5顯色

每孔依次加入底物液A50μL，底物液B50μL，輕輕震蕩混勻后，蓋上蓋板膜，25℃室溫下避光反應(yīng)15min。

1.2.6終止和讀值

加入終止液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))，測(cè)定每孔OD值。

1.2.7樣品處理方法

取1mL水樣于1．5mL離心管中;采樣不同的富集方式進(jìn)行濃縮;加入樣本復(fù)溶液0．2mL，渦旋震蕩5min后用于點(diǎn)樣(樣本稀釋倍數(shù)為0．2倍)。

1.3計(jì)算方法

標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的平均吸光度值(平均OD值)除以零標(biāo)準(zhǔn)的平均吸光度值(平均OD值)，再乘以100。零標(biāo)準(zhǔn)為100%(最大吸光度值)，其他OD值為最大吸光度的百分?jǐn)?shù)。吸光度值%=BB0×100%式中B———標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值B0———0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值校準(zhǔn)曲線以log(標(biāo)準(zhǔn)品濃度)為橫坐標(biāo)，以Logit(B/B0)為縱坐標(biāo)，構(gòu)建線性回歸方程。將樣品的Logit(B/B0)值代入上述回歸方程，求得的值乘以樣本稀釋倍數(shù)0．2，即為樣本中氯霉素含量。

2結(jié)果與分析

2.1水中氯霉素的富集

2.1.1富集方式的選擇

水中痕量抗生素富集方法可以用凍干法或氮吹濃縮富集法。凍干法是取1mL水樣品，冷凍成冰干燥過(guò)夜后再測(cè)定。選取了新鮮制備的雙蒸水作為陰性樣本。通過(guò)在1mL陰性樣本中添加不同量的氯霉素，對(duì)兩種方法進(jìn)行回收率對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。對(duì)比試驗(yàn)表明凍干法回收率略高于氮吹法。凍干法可很好地實(shí)現(xiàn)水溶液中氯霉素的富集，但操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(16h以上)，且需要配備凍干機(jī)。氮吹濃縮時(shí)間較短，試驗(yàn)回收率也能滿足回收率＞70%的檢測(cè)要求。本次選用氮吹濃縮進(jìn)行水中氯霉素的富集。

2.1.2富集用有機(jī)溶劑的選擇

因水相對(duì)常用有機(jī)溶劑來(lái)說(shuō)沸點(diǎn)較高，不易吹干，需通過(guò)往水中摻和有機(jī)溶劑形成低沸混合物的方法來(lái)有效降低水的沸點(diǎn)，從而提高氮吹濃縮時(shí)效。根據(jù)氯霉素的溶解性、有機(jī)溶劑與水的互溶性、共沸物形成情況等因素，選定乙腈作為水中氯霉素濃縮富集的有機(jī)溶劑。

2.1.3富集用有機(jī)溶劑與水比例的選擇

1mL水樣品中添加不同含量乙腈對(duì)濃縮干燥時(shí)間有一定影響。在78℃加熱，1mL水樣品中添加1，3，5，7，9和11mL的乙腈，干燥時(shí)間如下表2所示。隨乙腈加量增加，干燥時(shí)間先降后升。當(dāng)乙腈:水比例為9∶1時(shí)，所需時(shí)間最短，此時(shí)最接近乙腈－水共沸物(乙腈含量85%，共沸點(diǎn)76℃)［10］。故選用乙腈∶水(9∶1)作為富集用低沸混合溶劑。不同乙腈摻和量的樣品干燥時(shí)間如表2所示。

2.2試劑盒有效性復(fù)核

2.2.1線性檢測(cè)

配置0，25，100，400和1600ng/L的5點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值為0．993，線性較好，符合檢測(cè)要求。氯霉素ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

2.2.2檢出限

以超純水為空白樣品，測(cè)定6個(gè)空白樣品的平均值，再加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差，即為檢測(cè)限。配置0，25，100，400，1600ng/L的5點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線(R2=0．993)，計(jì)算由上表可知檢測(cè)限為24．81ng/L，與試劑盒檢出限標(biāo)識(shí)相符。

2.3實(shí)際樣品測(cè)試

選取了具有代表性的5個(gè)出廠水和6個(gè)管網(wǎng)水點(diǎn)位的樣本進(jìn)行了實(shí)際樣品檢測(cè)。5個(gè)出廠水，分別編號(hào)為:CC1，CC2，CC3，CC4，CC5;6個(gè)管網(wǎng)水，分別編號(hào)為GW1，GW2，GW3，GW4，GW5，GW6。平行測(cè)試3次，取平均值，測(cè)定結(jié)果如表4所示。

3結(jié)論

①通過(guò)優(yōu)化選擇，獲得了水質(zhì)樣本ELISA檢測(cè)前處理的合適方法。將進(jìn)一步提高ELISA檢測(cè)在水環(huán)境檢測(cè)中的應(yīng)用前景。

②氮吹－ELISA法的建立應(yīng)用，大大提高了檢測(cè)時(shí)效，適合水質(zhì)樣品的快速篩查定量。該方法對(duì)控制水質(zhì)安全，應(yīng)對(duì)突發(fā)性安全事件等水質(zhì)監(jiān)控具有重要意義。

參考文獻(xiàn):

［2］周正紅，鄧斌，林保銀．氯霉素類抗生素殘留分析研究進(jìn)展［J］．肉類研究，2006，2(1)，34－38．

［3］韓敏奇，蔣增輝，陸志惠，等．酶聯(lián)免疫法測(cè)定上海原水中四環(huán)素濃度［J］．供水技術(shù)，2015，9(6):57－59．

［4］彭莉，岳秀英．高效液相色譜法測(cè)定牛奶中的氯霉素殘留［J］．中國(guó)獸醫(yī)藥志，2002，36(8):23－24，22．

［5］李蘭生，王勇強(qiáng)．氯霉素在對(duì)蝦全內(nèi)的動(dòng)力學(xué)研究［J］．色譜，1997，15(5):431．

［6］王太全，錢成，徐成，等．氣相色譜法測(cè)定出品龍蝦中氯霉素殘留量的研究［J］．肉品衛(wèi)生，2003，9(1):11－14．

［7］孫亮，陳海東．GC－MS/MS測(cè)定蝦仁中氯霉素的研究［J］．中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2003，13(3):293－294．

［8］張輝．離子阱時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定食品中的氯霉素［J］．浙江科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，15(11):46－47．

［9］楊成對(duì)，宋莉暉，毛麗哈，等．對(duì)蝦中氯霉素殘留的分析方法研究［J］．分析化學(xué)研究簡(jiǎn)報(bào)，2004，32(7):905－907．

［10］穆光照．實(shí)用溶劑手冊(cè)［M］．上海:上海科技出版社，1990．

作者:劉靜 董煜杰 嚴(yán)義勇 單位:成都市自來(lái)水有限責(zé)任公司水質(zhì)中心 深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司