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【摘要】根據歷史文獻和現代哈蟆油研究的成果，進行整理、分析、總結，闡述了哈蟆油質量控制現狀和方法，從傳統的基源鑒別發展到性狀鑒別、顯微鑒別、色譜法、光譜法以及生物鑒定法，尤其是現展較好的氣相色譜、高效液相色譜、電泳色譜、PCR技術以及指紋圖譜技術的應用使哈蟆油的研究進入了一個更高的科學領域。對哈蟆油的鑒定手段不斷的完善，為提高哈蟆油質量控制和鑒別真偽提供了依據。

【關鍵詞】中藥；哈蟆油；質量控制方法

前言

藥材的真偽鑒別和品質評價是臨床應用、成藥制備、中藥科研不可缺少的前提條件。我國藥材品種繁多，據統計約有一萬二千多種，由于地大物博，南北差異，同名異物、同物異名的混淆品種極多，療效各不相同。而且中藥的有效成分和環境、產地、采收季節等因素也有很大關系；加之近年來，假冒偽劣中藥充斥市場，為控制中藥質量、保證臨床用藥安全和有效，中藥鑒定技術由傳統的性狀鑒別，如眼觀、鼻聞、口嘗、手摸升華、水火試等，對藥物的形狀、大小、輕重、顏色、表面特征、折斷面紋理、氣味、黏性、酸堿性等進行正確鑒別和描述，到現代的色譜法、光譜法、X射線分析法、熱分析法、分子生物學技術等。哈蟆油OviductusRanae）為蛙科動物中國林蛙RanatemporariachensinensisDavid雌蛙的輸卵管，經采制干燥而得。據《中國藥典》（2005年版）Ⅰ部收載，具有補腎益精，潤肺養陰的功效，用于陰虛體弱，神疲乏力，心悸失眠，盜汗不止，癆嗽咳血［1］等癥狀。隨著中藥現代化技術的發展，哈蟆油的質量控制技術也在不斷的提高。

1基源鑒定法

基源鑒定法就是應用植物、動物或礦物形態和分類學等方面的知識，對中藥的來源進行鑒定。中國林蛙的形態特征［2］為：體長5～7cm；頭長等于或大于寬，口內鋤骨齒位于肉鼻孔后方，排列成兩短行；兩側耳無后腺；背面黃褐色，較平滑；腹面黃白色，胸骨平坦，下肢部兩側稍膨大；后肢長為軀體的1.5倍。

2性狀鑒別法

哈蟆油呈不規則的塊狀，彎曲而重疊，長1.5～2cm，厚1.5～5mm，表面黃白色，呈脂肪樣光澤，偶有帶灰白色薄膜狀干皮。摸之有滑膩感，在溫水中浸泡體積可膨脹10～15倍［3］。氣腥，味微甘，嚼之有黏滑感［1］。

3顯微鑒別法

董萬超等［4］報道了林蛙油的顯微特征如下：加碘酊染色后，在顯微鏡下觀察，呈金黃色。腺體細胞肥大，呈長橢圓形，排列整齊，細胞壁明顯，靠腺體內腔一端較窄，細胞壁凸起，細胞核橢圓形，位于細胞中間稍偏向腺體內腔一面，腺體底部較寬，上端較狹，呈圓錐形。腺體內開口呈心臟形，內凹，整個腺體布滿細小紋理。為鑒別哈蟆油與中華大蟾蜍輸卵管、明太魚精巢、瓊脂蛋白加工品、馬鈴薯甘薯的偽制品提供了依據。

4理化鑒別法

4.1熒光檢查劉秀峰等［5］

報道了哈蟆油干品在365nm下呈黃色的熒光；乙醇浸出物在254nm下呈藍白色熒光［4］。

4.2化學定性分析據報道［4］蛤蟆油水浸液雙縮脲反應為深紫紅色；加茚三酮試劑，反應為深藍紫色。為鑒別真偽提供了依據。

4.3化學定量分析1991年，劉永鎮等［6］利用哈蟆油與Fehling試劑生成沉淀的反應，定量的鑒別了哈蟆油與其偽品蟾蜍輸卵管。錢笈締等［7］采用蛋白質自動分析儀測定冰糖哈蟆油中蛋白質的含量，探索了動物藥制劑的指控方法。王秋雨等［8］采用半微量的凱氏定氮法測定了哈蟆油和青蛙油中蛋白質的含量分別為72.8％和73.8％。

4.4光譜分析法

4.4.1可見分光光度法衛功慶等［9］用美國產DU650分光光度計，在553nm下測定了哈蟆油和青蛙油中膽固醇的含量，分別為2.12，4.92mg/kg，由此確定哈蟆油比較適合中老年人服用。

4.4.2紫外光譜法李明剛等［10］在0～360nm下對哈蟆油和中華大蟾蜍輸卵管95％乙醇浸出物進行了紫外檢測，結果哈蟆油9個吸收峰分別位于4，114，129，252，256，275，311，312，314nm；中華大蟾蜍輸卵管8個吸收峰分別位于4，113，131，216，245，275，298，315nm；王麗蘭等［11］紫外光譜法測定了哈蟆油中總核酸的含量為2.69%，DNA為（0.13±0.01）%，RNA為（2.56±0.05）%。2006年，作者報道了采用紫外譜線組法，對不同產地和不同溶劑提取的哈蟆油正品和偽品的紫外及其一階導數光譜進行了檢測，為哈蟆油的質量控制和真偽鑒別提供了依據［12，13］。

4.4.3紅外光譜法對哈蟆油的紅外光譜的報道較少，丘澤雨等［14］對不同產地的珍珠、蟾蜍、哈蟆油、冬蟲夏草、五靈脂的同種藥材進行了對比研究，并用紅外光譜法進行了藥材真偽優劣鑒別。

4.4.4原子吸收光譜法和發射光譜法王秋雨等［8］用原子分光光度計(VARIANAa220)和等離子發射光譜儀(日立Z-8200)測定了哈蟆油與青蛙油中微量元素和重金屬的含量，結果哈蟆油與青蛙油均含有人體必需的常用微量元素,但青蛙油中重金屬Pb及Hg含量超標。李媛媛等［15］采用等離子體發射光譜法對國產和俄羅斯產哈蟆油無機元素的含量進行了分析。

4.5色譜分析法

4.5.1薄層色譜法劉永鎮等［15］研究證實,用丙酮提取物乙醚萃取后的殘留物,在石油醚∶醋酸乙酯（4∶1）展開的薄層層析中,其Rf值為0.4，用展開劑苯∶乙醚∶甲醇（10∶5∶0.8），顯色劑（茴香醛∶冰乙酸∶濃硫酸1∶100∶2）測定,效果良好。李明剛等［10］采用苯∶乙醚∶甲醇（10∶5∶0.8）為展開劑，茴香醛∶冰乙酸∶濃硫酸（1∶100∶2）為顯色劑，對哈蟆油和中華大蟾蜍輸卵管進行了鑒別。趙文英等［16］用丙酮連續回流提取法，以石油醚：醋酸乙酯（4∶1）為展開劑，36％的乙酸∶濃硫酸（1∶1）為顯色劑，展距20cm，分別在自然光及紫外光（365nm）下，對不同來源的哈蟆油正品以及不同種類的偽品進行了鑒別。目前，作者正在對哈蟆油進行系統的薄層色譜研究，比較不同極性的溶劑和提取方法下哈蟆油的薄層效果從而建立哈蟆油系統的薄層色譜條件，建立哈蟆油專屬性鑒別方法。

4.5.2高效液相色譜法李成義等［17］應用HPLC測定了哈蟆油中磷脂的含量；多年來，作者對哈蟆油的有效成分進行了較深入地研究，已分離出了多個化合物［18］，其中，十六烷酸膽甾醇酯為首次從哈蟆油中提取純化出來的，作者以十六烷酸膽甾醇酯為化學對照品，利用HPLC法對哈蟆油進行了含量測定及其方法學的研究，為建立一個完整、科學的哈蟆油質量評價方法提供依據［19］。李津明等［20］采用了反相高效液相色譜技術，對10批不同來源的林蛙油藥材建立了高效液相色譜指紋圖譜，從而提高了哈蟆油的質量控制技術。

4.5.3氣相色譜-質譜法趙文英等［21］利用氣相色譜-質譜法(GC-MS)，對哈蟆油石油醚提取物分離出的脂肪酸進行分析，發現哈蟆油不飽和脂肪酸含量約占脂肪酸含量的40%；盧立明等［22］利用GC-MS對哈蟆油脂溶性部分的化學成分進行了研究，結果表明哈蟆油中含有多種不飽和脂肪酸和奇數碳原子脂肪酸。李成義等［17］利用GC-MS法，從吉林產哈蟆油中檢定出9種酸。其中亞油酸的相對百分含量為36.05%,花生四烯酸的相對百分含量為1.63%。劉玉翠等［23］利用GC-MS法對哈蟆油的一組脂溶性成分進行分析,共分離鑒定了5種酯類化合物。季怡萍［24］用氣相色譜(GC)與氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用技術對哈士蟆油中的脂肪酸組成進行了定性與定量分析,共鑒定出10種脂肪酸并用氣相色譜法作了定量。王秋雨等［8］利用氣相色譜-質譜(GC-MS)測定哈蟆油與青蛙油脂類物質含量基本一致，約為6%，其中不飽和脂肪酸含量分別占其脂肪酸的77.26%和64.67%。

4.6電泳分析法趙華英［25］采用PA-GE技術,對哈士蟆油及其偽品:黑斑蛙(習稱青蛙)、中華大蟾蜍的輸卵管進行酯酶同工酶和可溶性蛋白質的電泳分析。結果酯酶同工酶圖譜可見：哈士蟆油共有2條譜帶，A區1條三級帶，B區1條一級帶。黑斑蛙有7條譜帶，分布在B區和C區。中華大蟾蜍有2條譜帶，分布在B區和C區。可溶性蛋白質電泳圖譜。可見哈士蟆油在C區有C2和C62條一級帶可與偽品鑒別。因為黑斑蛙只有C3一級帶，而中華大蟾蜍C區無一級帶。曾明［26］、石俊英等［27］采用凝膠電泳法測得哈蟆油一級帶三條，二級帶兩條，三級帶一條，為鑒別哈蟆油與其易混品種雞內金、蟾酥等提供了依據。新晨

5生物鑒定法

5.1放射性免疫分析法林紀嫻等［28］采用放射性免疫分析法對中國林蛙和中華大蟾蜍輸卵管中睪酮的含量進行了分析；李成義［17］、白云等［29］先后采用了放射性免疫分析法測定了哈蟆油中激素的含量。

5.2多聚酶鏈式反應（PCR）技術楊學干等［30］從中國林蛙(Ranachensinensis)、中華大蟾蜍(Bufogargarizans)以及鱈魚(Gadusmacrocephalus)等組織材料中提取DNA，擴增出約340bp的12SrRNA基因片段，測定其序列，并參考有關序列，設計一對哈蟆油的鑒別引物HsmL1，HsmH1，用該鑒別引物擴增蛙類原動物的模板DNA時，只有中國林蛙和黑龍江林蛙的模板能得到陽性擴增，其余樣品為陰性。因此該對引物能用于哈蟆油藥材來源的鑒別，對購自5個不同藥材商店的哈蟆油PCR鑒定結果表明，現市售商品哈蟆油有不同的材料來源，主要因為哈蟆油是由中國林蛙輸卵管干制而成，這種以組織器官制成的藥材鑒定難度大，易用其它動物相似的器官組織冒充,如黑斑側褶蛙、中華大蟾蜍、鱈魚等的輸卵管或精巢等加工品。該研究得到的鑒別引物能準確地對該藥材的來源加以區別。

【參考文獻】

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［4］董萬超，張秀蓮，張寶香，等.林蛙及其油的利用概況［J］.特種經濟動植物，1998，(2):11.

［5］劉秀峰，紀成茂.哈蟆油及其偽品的鑒別［J］.海峽藥學，1997,9(2):107.

［6］劉永鎮，崔順錦，南善姬.蛤蟆油與其偽品蟾蜍輸卵管的簡易理化鑒別［J］.延邊醫學院學報,1991,14(2):109.

［7］錢笈締，王培麗.冰糖哈士蟆油質量控制初探［J］.中成藥,1996,18(2)：43.

［8］王秋雨，金莉莉，婁虹，等.哈蟆油和青蛙油主要營養成分的測定［J］.特產研究，2003,(4):37.

［9］衛功慶，楊寶田，張愛武，等.哈士蟆油與青蛙油脂肪酸及膽固醇的比較研究［J］.吉林農業大學學報,1999,21(增刊):39.