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摘要:為了提高小鵝瘟病毒pcr檢測(cè)的檢出率，試驗(yàn)根據(jù)現(xiàn)有的小鵝瘟病毒基因序列，設(shè)計(jì)合成了1對(duì)特異性引物，以實(shí)驗(yàn)室中保存的小鵝瘟病料DNA為模板，對(duì)反應(yīng)程序中的延伸時(shí)間、退火溫度等循環(huán)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行了敏感性和特異性檢測(cè)。結(jié)果表明:優(yōu)化后的延伸時(shí)間為45s，退火溫度為48.0℃;優(yōu)化后的方法對(duì)小鵝瘟病毒可擴(kuò)增出大小為550bp的特異性條帶，對(duì)照毒株擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，其靈敏度為146.00pg/μL。說(shuō)明優(yōu)化后的PCR方法特異性強(qiáng)、敏感性高，反應(yīng)時(shí)間明顯縮短。

關(guān)鍵詞:小鵝瘟;PCR;條件優(yōu)化;DNA病毒;敏感性

小鵝瘟(goslingplague，GP)是由細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒屬中的鵝細(xì)小病毒(Gooseparvoviruse，GPV)引起的一種雛鵝急性或亞急性的敗血性傳染病。該病主要發(fā)生于2周齡以內(nèi)的雛鵝，具有發(fā)病率高、致死率高和傳播速度快等特點(diǎn)。朱堃熹等［1］對(duì)40例典型病例進(jìn)行了系統(tǒng)的病理解剖學(xué)研究，結(jié)果顯示，該病的主要病變?yōu)榧毙钥ㄋ裕w維素性壞死性小腸炎，可引起小腸梗阻。自1962年方定一［2］及其研究團(tuán)隊(duì)首次發(fā)現(xiàn)此病以來(lái)，多家研究單位研究和建立了GPV的PCR快速檢測(cè)方法［3－6］，但其條件未能達(dá)到最佳，趙磊等［7］對(duì)GPVDNA的提取方法進(jìn)行了優(yōu)化，確定以微量法提取GPV核酸最具優(yōu)勢(shì)。本試驗(yàn)對(duì)GPVPCR檢測(cè)的延伸時(shí)間、退火溫度等循環(huán)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，并檢測(cè)了特異性和敏感性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1病毒Ⅰ型鴨病毒性肝炎病毒(DHAV－Ⅰ)、Ⅲ型鴨病毒性肝炎病毒(DHAV－Ⅲ)、鴨瘟病毒(Duckplaguevirus，DPV)、GPV、鴨圓環(huán)病毒(Duckcircovirus，DuCV)、番鴨細(xì)小病毒((Muscovyduckparvoviru，MDPV)、鴨副黏病毒(Duckparamyxoviru，DPMV)、新型鴨肝炎病毒(NCHV)，均由西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院動(dòng)物疾病快速診斷中心保存。

1.2主要試劑及儀器DNA提取試劑盒、rTaqDNA聚合酶、DL－2000Marker、TEBuffer，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;BiodropuLITE分光光度計(jì)，由西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院動(dòng)物疾病快速診斷中心提供。

1.3引物根據(jù)GPV的基因序列，應(yīng)用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)寡聚核苷酸引物，序列為上游引物5'－CCAAGCTACAACAACCACATCTAC－3'和下游引物5'－CTGCGGCAGGGCATAGACATCCGAC－3'，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4病毒DNA的提取取西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院動(dòng)物疾病快速診斷中心保存的GPV，參照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病毒DNA。

1.5PCR檢測(cè)方法的建立與優(yōu)化反應(yīng)體系:GPVDNA模板3μL，rTaqDNA聚合酶12.5μL，上、下引物各1μL，用7.5μLddH2O補(bǔ)至25μL。對(duì)反應(yīng)程序中的延伸時(shí)間、退火溫度等循環(huán)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)程序。設(shè)定延伸時(shí)間分別為15，30，45，60，75，90s;退火溫度分別為38.0，39.8，44.3，47.2，48.0，54.5，61.5，65.0℃。

1.6PCR敏感性檢測(cè)用BiodropuLITE分光光度計(jì)在OD260/OD280值下測(cè)得DNA原濃度為934.37ng/μL，用TEBuffer對(duì)原濃度DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋至93.437pg/μL，再對(duì)濃度為934.37×10－2ng/μL的DNA進(jìn)行2倍梯度稀釋，分別測(cè)定每次稀釋后的DNA濃度，并各取3μL加到反應(yīng)體系中進(jìn)行敏感性檢測(cè)。

1.7PCR特異性檢測(cè)用優(yōu)化后的最佳反應(yīng)程序?qū)HAV－Ⅰ、DHAV－Ⅲ、DPV、GPV、DuCV、MDPV、DPMV、NCHV的DNA或cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2結(jié)果與分析

2.1PCR檢測(cè)方法的建立與優(yōu)化對(duì)反應(yīng)程序中的延伸時(shí)間、退火溫度等循環(huán)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)程序。

2.1.1延伸時(shí)間的篩選保持其他條件不變，設(shè)定延伸時(shí)間分別15，30，45，60，75，90s進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果延伸時(shí)間為45s時(shí)擴(kuò)增得到的條帶最亮。

2.1.2退火溫度的篩選保持其他條件不變，設(shè)定退火溫度梯度為38.0～65.0℃進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果退火溫度為48.0℃時(shí)擴(kuò)增得到的條帶最亮。

2.1.3PCR擴(kuò)增根據(jù)2.1.1和2.1.2的篩選結(jié)果確定最佳的反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性5min;95℃變性1min，48.0℃退火1min，72℃延伸45s，共30個(gè)循環(huán);72℃再延伸5min，12℃保存。

2.2PCR敏感性檢測(cè)

結(jié)果顯示，采用10倍稀釋和2倍稀釋的方法可在146.00pg/μL～934.37ng/μL范圍內(nèi)擴(kuò)增出清晰的條帶，濃度為93.437pg/μL時(shí)未擴(kuò)增出條帶。說(shuō)明優(yōu)化后的PCR方法檢測(cè)GPV的靈敏度為146.00pg/μL。2.3PCR特異性檢測(cè)結(jié)果顯示，優(yōu)化后的PCR方法能檢測(cè)到標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性GPV毒株，而對(duì)DHAV－Ⅰ、DHAV－Ⅲ、DPV、DuCV、MDPV、DPMV、NCHV均檢測(cè)不到特異性條帶。

3討論

小鵝瘟是導(dǎo)致雛鵝死亡的常見(jiàn)疾病之一，可造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重危害養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)展。目前，對(duì)GPV的檢測(cè)技術(shù)主要有瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)［8－9］、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)［10］、免疫酶斑點(diǎn)法［11］、免疫熒光試驗(yàn)［12］和PCR檢測(cè)方法等。隨著分子生物學(xué)診斷技術(shù)的不斷發(fā)展，PCR快速檢測(cè)方法省時(shí)省力，得到了認(rèn)可并成為最常用的檢測(cè)方式。本試驗(yàn)利用保存于實(shí)驗(yàn)室的GPV，對(duì)已有的小鵝瘟PCR檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化，篩選出反應(yīng)時(shí)間最短、反應(yīng)效率最高的一組條件，特異性

作者：童艷梅；李嫻妍；陳義旺；馬曉強(qiáng)；顧江風(fēng)；楊夢(mèng)琪；劉雨；楊曉偉；趙光偉 單位：西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系