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《電子顯微學報》2016年第5期

摘要:

本文通過使用電子斷層成像技術，分別對納米金樣品和納米囊泡藥物兩種材料進行多角度成像研究，發現納米金樣品為圓盤狀，并沒有棒狀結構，同時還測量了納米金盤的厚度。納米囊泡擬包含藥物為膜狀結構而非針狀或棒狀。多角度成像排除了二維電鏡圖片的假象，顯示電子斷層成像技術在納米材料的應用前景。

關鍵詞:

電子斷層成像技術;納米金樣品;納米囊泡藥物

入射電子與物質相互作用時會產生二次電子、背散射電子、透射電子和特征X射線等各種信號。其中透射電子、背散射電子是透射電鏡的主要成像信號。透射電鏡中，電子束與樣品相互作用，在熒光屏(或圖像收集設備)上顯示該樣品的投影信息，因此透射電鏡圖像是一個三維物體垂直于電子束入射方向的二維投影，對于均質球體來說，任何角度投影的圖像都能正確顯示其形狀和尺寸。但由于無法直接從該二維投影了解該物體在三維空間里的立體結構信息，對于圓盤狀、薄片狀或其他特殊形狀的樣品，某些特定角度的投影容易產生對三維立體結構分析上的假象。旋轉樣品，獲得樣品在不同方向上的投影圖，再通過計算機軟件處理這一系列投影圖，還原樣品三維空間里的立體結構信息，這樣的技術被稱為“電子斷層成像技術”［1］。利用這種技術可以恢復樣品的原有立體形貌，消除部分二維投影的假象。這種技術近年來，在細胞、亞細胞結構的研究獲得了很廣泛的應用，得到不少令人矚目的結果［2－3］。但在納米材料上的應用，尤其在國內的納米材料方面，鮮見報道。本文利用電子斷層成像技術，分別對納米金樣品和納米囊泡藥物兩種材料進行研究，獲得這兩種材料的三維立體結構。

1材料與方法

1.1材料

納米金樣品由中山大學物理與工程學院提供。納米囊泡藥物由中山大學藥學院提供。

1.2方法

1.2.1納米金樣品的電鏡制樣方法

取5μL納米金樣品懸液(濃度為7.5×10－11mol•L－1)［4］滴到碳膜銅網上，1min后用濾紙吸去多余的懸液，在室溫下自然干燥。

1.2.2納米囊泡藥物的冷凍電鏡制樣方法

在冷凍制樣前，為提高微篩膜銅網(Quantifoil)的親水性，對該銅網進行輝光放電親水處理。同時，為了后續不同角度投影的對準，在制樣前新鮮加入10nm的膠體金顆粒。具體制樣過程為:取4μL納米囊泡藥物(濃度為5×10－6mol•L－1)，加1μL10nm的膠體金顆粒溶液(濃度為1×10－5mol•L－1)，混勻后，立刻滴加在已處理的微篩膜銅網上，使用FEIVITROBOTIV進行冷凍制樣，濾紙吸附時間為3s，轉移銅網并保存在液氮中。通過Gatan626冷凍樣品傳輸架，將樣品轉移到JEM2010Cryo型電鏡，－173℃進行觀察拍照。

1.2.3電鏡拍攝方法

上述兩樣品均使用JEM2010Cryo型電鏡手動收集一系列傾斜角度的投影圖像［5－7］，加速電壓為200kV，圖像收集采用Gatan895CCD。采集圖像放大倍數分別為30K和50K，每2°收集一次圖像，傾斜角度為±54°。用IMOD軟件［8］對收集的圖像進行計算機三維重構。三維結構采用Chimera軟件顯示。

2結果與討論

2.1納米金樣品

納米金樣品的二維投影見圖1。圖中可見樣品有3種形態，分別呈現圓形(A)、桿狀(B)和三角形(C)，一般可以根據該圖分析得出該樣品有3種形態。圖2是同一個納米金樣品在不同旋轉角度的投影照片。圖2a中顯示兩個樣品分別呈現橢圓形(白色箭頭)和桿狀(黑色箭頭)兩種形態。將該樣品從－40°傾斜角度旋轉至0°時，可見圖2a中的桿狀樣品投影(黑色箭頭)變成圖2c中的橢圓形狀，圖2a中的橢圓形樣品(白色箭頭)變成圖2c中的桿狀。圖2d中，顯示兩橢圓形樣品稍有重合。圖2e中，兩樣品均呈現橢圓形狀。可見圓形和桿狀的二維投影，實際是同一個納米金樣品在不同方向上的投影。經IMOD軟件處理并重構得到的三維結構結果顯示(圖3)，該納米金樣品的兩個顆粒實際均呈圓餅狀的結構，直徑為45nm，厚度為10nm。

2.2納米囊泡藥物

圖4是納米囊泡藥物的透射電鏡二維投影照片。圖中白色箭頭所示樣品為近似球狀的囊泡結構，囊泡里含有短棍狀的結構，白色箭頭所示樣品形態為針狀。圖5顯示該納米囊泡藥物在旋轉不同角度時透射電鏡的投影照片。圖5中白色箭頭標示的針狀樣品(5d，e)，隨著旋轉角度不同，投影圖像發生了形態改變，從原來襯度很大的針狀，變成襯度很小，難以分辨的膜狀結構(白色箭頭)(5a，b)。這是同一個樣品因為旋轉角度不同而產生的不同投影圖形。由于薄膜狀樣品的Z軸方向厚度很薄，而X軸和Y軸方向厚度較大，假設電子束沿樣品的X軸或Y軸方向入射時，將難以穿透樣品，這兩個方向的投影襯度較大，成一針狀結構(5d，e白色箭頭)，其投影短徑反映Z軸的樣品厚度。沿樣品Z軸方向入射的電子束，由于Z軸方向上的樣品厚度很薄，電子束可輕易透過，引起的襯度變化小，因此其二維投影的反差極弱(圖5a白色箭頭)。而對于囊泡狀的樣品來說，由于其結構近似球形，因此在不同的角度，其投影都是近似圓環結構(圖5黑色箭頭)。同樣，圖5中黑色箭頭所示的囊泡狀樣品內部包含的藥物結構在不同方向上的投影因旋轉角度不同而發生了變化。可見在圖5c中黑色箭頭所示囊泡內包含有一短棍狀藥物，但隨著傾斜角度變化，在圖5a中，同一個囊泡內的藥物反差非常弱，難以分辨。說明這個囊泡內包含的藥物與囊泡外的藥物是類似的膜狀結構。使用IMOD軟件將納米囊泡藥物重建為三維模型(圖6)，顯示囊泡中包裹的短棒狀結構實際上是膜狀結構，厚度僅為10nm。

3結論

三維物體沿單個角度的投影很難體現該樣品的全部形貌信息，特別是非對稱性樣品在不同方向的投影形態各異，僅采用一個投影角度獲得的透射電鏡二維圖像很容易錯誤判斷該樣品的三維形貌。電子斷層成像技術通過旋轉樣品拍攝一系列角度的多張投影照片，可以獲得該樣品多個角度的信息，如能經過計算機重構更可獲得較為直觀的三維結構，避免單角度拍攝引起的假象。可見對于觀察納米材料而言，電子斷層和多角度成像技術是一項非常重要的技術，對正確獲得樣品的三維信息具有不可替代的意義。

作者:李茵茵 蔣中鳴 李紅梅 賈旭東 張勤奮 單位:中山大學生命科學學院 昆明理工大學材料科學與工程系