本站小編為你精心準備了降解菌的分離鑒定及其降解特性參考范文，愿這些范文能點燃您思維的火花，激發您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

《福建農林大學學報》2016年第3期

摘要:

從雜草土壤中分離得到利用甾類化合物作為唯一碳源的菌株D61．經16SrDNA多態性分析鑒定菌株D61為腸桿菌科哈夫尼菌屬，在20～37℃、pH2．0～9．0的環境中生長較好，無卡那霉素抗性．降解試驗和熒光定量PCR試驗結果表明，菌株D61可通過paaC基因的環氧化作用途徑對甾類化合物進行降解轉化，其對睪丸酮的降解能力與陽性對照菌睪丸酮叢毛單胞菌相似，對雌酮的降解能力明顯優于睪丸酮叢毛單胞菌．

關鍵詞:

甾類化合物;降解;菌株D61

隨著社會的不斷發展，特別是現代醫藥及化學工業的發展，包括睪丸酮、雌二醇和雌酮在內的大量甾類化合物不斷地通過生產或生活等釋放并污染土壤和水，給地球上的生物包括人類的生長、發育和繁殖都構成潛在的威脅和風險［1］．甾類化合物污染的研究始于上世紀90年代．我國2000年開始對環境甾類化合物污染、毒理學等方面進行大量研究，發現我國重要河流、淡水湖泊，以及近海海域和污水灌溉土壤中，均存在不同程度的類固醇污染［2－4］．因此，國內外學者積極地從環境中篩選分離甾類化合物降解菌［5－9］．陶玉貴等［10］從農藥廠排污溝污泥中分離得到1株哈夫尼菌屬菌株，能以毒死蜱為唯一碳源降解毒死蜱．除此之外，鮮有以哈夫尼菌作為降解菌的研究報道，更無哈夫尼菌降解甾類化合物的相關研究報道．戴藝民、陳建秋等［11－12］對降解甾類化合物細菌———睪丸酮叢毛單胞菌進行研究．本研究嘗試從周邊環境分離新甾類化合物降解菌，并對其降解特性進行研究，為進一步利用新分離菌株進行環境修復及降解機理的研究提供依據．

1材料與方法

1．1材料和儀器1．1．1材料以福建農林大學生物樓前雜草土壤作為分離甾類化合物降解菌的材料．以本實驗室保存的睪丸酮叢毛單胞菌作為陽性對照菌株．無機鹽培養基(SIN):1．0g·L－1(NH4)H2PO4+1．0g·L－1(NH4)2HPO4+2．0g·L－1KH2PO4+0．2g·L－1MgSO4·7H2O，pH7．0．LB培養基:10g·L－1蛋白胨+5g·L－1酵母膏+10g·L－1NaCl，pH7．0．固體培養基添加14g·L－1瓊脂，相關培養基經120℃高壓蒸汽滅菌25min，備用．睪丸酮、雌二醇和雌酮由大連美侖生物公司提供．1．1．2主要儀器設備96孔PCR儀(型號AG22331)，為德國艾本德股份公司產品;高效液相色譜儀(型號1260)，為安捷倫科技有限公司產品;冷凍離心機(型號5810R)，為德國艾本德股份公司產品;PikoReal熒光定量PCR儀(型號5100)，為賽默飛世爾科技(芬蘭)有限公司產品．

1．2方法

1．2．1甾類化合物降解菌株的分離稱取5g土壤加到含有0．2mmol·L－1睪丸酮的SIN液體培養基中，在37℃、180r·min－1搖床中培養．每3d按1%的接種量，取前一次培養的菌液依次在含有0．4、0．6和1．0mmol·L－1睪丸酮的SIN液體培養基中富集培養．參考Sangetal［6］和于源華等［7］從海水中分離降解甾類化合物細菌的方法，將富集培養的菌液用無睪丸酮的SIN液體培養基按1∶106稀釋，取200μL分別均勻涂于5個含有1．0mmol·L－1睪丸酮的SIN固體培養基上，37℃過夜培養．從每個過夜培養的培養皿中挑取10個以上的單菌落(依次編號)，用30μL無睪丸酮的SIN液體培養基稀釋后，取5μL分別置于無睪丸酮的1/10SIN固體培養基A和含1．0mmol·L－1睪丸酮的1/10SIN固體培養基B中，挑選可有效利用睪丸酮作為碳源的菌株進行純化及進一步研究．

1．2．2新分離菌株的DNA提取及16SrDNA鑒定采用上海生工的細菌基因組DNA快速提取試劑盒進行DNA提取．采用細菌16SrDNAPCR擴增通用引物［13］(溶解濃度均為10μmol·L－1)對新分離菌株進行種屬鑒定．上游引物27F:5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3．下游引物1492R:5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3．PCR反體系為5μLBuffer+1μLdNTP+0．5μLrTag+2μL27F引物+2μL1492R引物+38．5μLdH2O，總體積為50μL．PCR擴增反應條件為:94℃5min，94℃1min，61℃1min，72℃1min，30個循環，72℃延伸10min．擴增產物送至鉑尚生物公司進行測序．將測序結果交至NCBI在線比對后，選擇相似度較高和具有代表性的相似菌種16SrDNA序列，用MEGA(版本號為6．06)進行多序列比對及系統進化樹繪制．

1．2．3新分離菌株的生長條件及抗性研究新分離菌株在LB培養基中經37℃、180r·min－1過夜培養后，用LB培養基將菌液調至D595nm=1．0．取250μL菌液加入5mLLB培養基，在180r·min－1搖床中分別按相應條件進行過夜培養．溫度分別為15、20、27和37℃．pH值分別為2．0、5．0、7．0、9．0和11．0．抗生素條件分別為100μg·mL－1氨芐青霉素(Amp)、30μg·mL－1卡那霉素(Kan)、50μg·mL－1鏈霉素(St)、50μg·mL－1利福平(Rif)和300μg·mL－1羧芐青霉素(Carb)．

1．2．4新分離菌株對不同甾類化合物的降解新分離菌株在37℃、180r·min－1搖床中過夜培養后，以LB培養基稀釋至D595nm=1．0．取250μL菌液加入分別含有0．2mmol·L－1睪丸酮、0．02mmol·L－1雌二醇、0．02mmol·L－1雌酮的5mLSIN和LB液體培養基中，各種處理均為3次重復，在37℃、180r·min－1搖床中培養19h后，通過高效液相進行各處理中甾類化合物的降解剩余量的檢測．菌株睪丸酮叢毛單胞菌(C．T．)按重復數和條件進行處理，作為降解試驗的陽性對照．

1．2．5高效液相檢測培養液中甾類化合物含量的測定將經降解處理的培養液置于85℃烘箱，烘干水分后，加入1mL色譜甲醇充分溶解，經尼龍濾膜(0．45μm)過濾后，高效液相檢測甾類化合物含量．高效液相色譜條件為:流動相甲醇∶水=80∶20;流速為0．8mL·min－1;上樣量為50μL;柱溫為30℃．檢測睪丸酮波長為254nm，出峰時間為6min．檢測雌二醇和雌酮的波長均為205nm，分別在5．2和5．5min出峰．

1．2．6苯乙酸降解蛋白目的基因(paaC)的克隆及其降解甾類化合物的差異表達分析根據UniProtKB中報道的A0A038CSW7的苯乙酸降解蛋白，經NCBI/BLAST/tblaxtn檢索，獲得相應基因paaC序列后，使用PrimerPremier5．0軟件設計上下游引物．以D61菌株的DNA為模板，上游引物paaCXHF:5'-．下游引物paaCXHR:5'．獲得paaC基因片段，將該片段與載體pMD18-T連接并轉化到Trans5αChemicallyCom-petentCell中，送至鉑尚生物技術(上海)有限公司進行測序．根據測序結果輸入NCBI進行對比，并使用PrimerPremier5．0軟件進行熒光定量PCR引物設計．以D61菌株的16SrDNA基因作為熒光定量PCR內參基因，內參基因上游引物QD616s-F:5'-GGAGCAAACAGGATTAGATACCC-3'．內參基因下游引物QD616s-R:5'-CGGAAGCCACGCCTCAA-3'．新分離菌株以LB培養基進行培養，對照添加甲醇進行培養．過夜培養后，分離菌體以全式金TransZo-lTMUp提取RNA，TaKaRaPrimeScriptTM1STStrandcDNASynthesisKit進行cDNA第1鏈的合成后，以PerfectRealtime染料法實時熒光定量試劑盒在PikoReal熒光定量PCR儀上對試驗樣品進行熒光定量PCR分析．

2.分析結果

2．1軟件分析，獲得在閾值600條件下的PCR反應循環數:Ct(處理目的基因)、Ct(處理內參基因)、Ct(對照目的基因)和Ct(對照內參基因)．應用相對定量方法計算特征基因表達的差異量2－△△Ct，其中:△△Ct=△Ct(處理)－△Ct(對照);△Ct(處理)=Ct(處理目的基因)－Ct(處理內參基因);△Ct(對照)=Ct(對照目的基因)－Ct(對照內參基因)．2結果與分析2．1甾類化合物降解菌的分離和純化富集培養后，經涂板挑菌分離篩選的63株細菌，在無睪丸酮的1/10SIN固體培養基A上無法生長或生長明顯緩慢，而有6個菌株在含1．0mmol·L－1睪丸酮的1/10SIN固體培養基B中能夠以睪丸酮為唯一碳源，較好地生長(圖1)．本試驗對上述6個菌株進行初步甾類化合物降解對比試驗，選取編號61的菌株(圖1箭頭所指示)，將其命名為D61，并進行劃線純化和進一步的生長條件研究和降解能力鑒定。

2．2新分離菌株D61的16SrDNA鑒定D61經16SrDNAPCR擴增和測序，獲得的序列長度為1391bp，在GenBank中比對后，選擇相似度較高的菌種及C．T．等有代表性的菌種16SrDNA序列，經MEGA(版本號為6．06)進行多序列比對，并繪得系統進化樹(圖2)．從圖2可知，其與數據庫中的腸桿菌科哈夫尼菌屬的大多數菌種的16SrDNA序列的相似度達到了98%以上，鑒定菌株D61屬于腸桿菌科哈夫尼菌屬．

2．3菌株D61的生長條件及抗性通過測定15～37℃菌株D61的生長量可知:菌株D61在15℃下，生長量明顯減少，而在20～37℃，可以正常生長，生長量接近15℃時的3倍(圖3)．通過不同pH值條件試驗可知，D61在pH值2．0～9．0范圍內均能較好生長，但在pH達到11時，其無法生長(圖4)．D61在添加一定量的氨芐青霉素、鏈霉素、利福平和羧芐青霉素的LB培養基內均能較好地生長，而在添加卡那霉素的LB培養基中幾乎無法生長(圖5)．由此可確定菌株D61后續試驗的培養條件為:pH值7．0，氨芐青霉素100μg·mL－1，溫度37℃．

2．4菌株D61對不同甾類化合物的降解效果菌株D61和C．T．在pH值7．0、100μg·mL－1氨芐青霉素、培養溫度37℃條件下培養19h后，通過高效液相測定培養基內剩余甾類化合物的含量，進而計算獲得相應菌株甾類化合物的降解率(圖6)．在營養物質匱乏的SIN液體培養基中，菌株D61和C．T．對睪丸酮的降解率分別為30．9%和30．5%，對雌二醇降解率分別為15．2%和16．4%，對雌酮降解率分別為60．6%和37．2%．在富營養的LB液體培養基中，菌株D61和C．T．對睪丸酮的降解率分別為70．5%和70．3%，對雌二醇降解率分別為21．1%和32．7%，對雌酮降解率分別為44．0%和35．1%．圖3D61菌株在不同培養溫度中的生長情況對比Fig．3ComparisonongrowthofD61strainunderdifferentculturetemperature

2．5paaC基因克隆及熒光定量PCR驗證D61菌株與C．T．菌株同樣具有降解甾類化合物的能力，但PCR和ELISA試驗結果表明，D61菌株中不含有3α-HSD基因．而以paaC基因特異引物對D61菌株的DNA進行PCR擴增，獲得756bp的特征片段，經測序比對分析，結果表明其與paaC基因的同源性達到99%(圖7)．根據測序結果，設計熒光定量PCR引物．paaCQF:5'-CTGTTCCACCAGCAGGAGATTG-3'．下游引物paaCQR:5'-CTGAGTTGGCGGGGAGCGGCGA-3'．熒光定量PCR結果顯示，在含有睪丸酮、雌二醇和雌酮的LB培養基中，paaC基因的表達量分別提高1．9、1．3和3．0倍，證明D61在降解以上3個甾類化合物時paaC基因具有一定活性。

3討論

本研究成功篩選分離出能夠利用睪丸酮作為碳源快速生長的菌株D61．通過16SrDNA序列的測定分析，初步鑒定菌株D61為腸桿菌科哈夫尼菌屬．本研究分離的哈夫尼菌屬D61菌株，在富營養的LB培養基和營養物質匱乏的SIN培養基中，對睪丸酮、雌二醇和雌酮均有一定的降解能力;且在相同試驗條件下，降解雌酮的效率明顯大于C．T．菌株，降解睪丸酮的效率基本與C．T．菌株相同．Teufeletal［14］研究指出，paaC等基因的環氧化作用使芳香族化合物的芳香族環上1個雙鍵兩端碳原子被加上一原子氧形成三元環，破壞芳香族環的穩定性;并在其他酶作用下芳香族環開環，最終被逐步降解．對D61菌株的paaC基因克隆及熒光定量PCR驗證結果表明，加入睪丸酮和雌酮后paaC基因表達量顯著增加．因此，環氧化反應的代謝途徑可能是D61菌株降解甾類化合物的重要途徑．通過對D61菌株的生長溫度、pH值和抗性等特點的研究，結果表明D61菌株可以應用于20～37℃、pH值酸性或弱堿性的環境中進行環境甾類化合物污染修復．同時，因D61菌株不適于在強堿性條件下生長和不抗卡那霉素的特點，故在環境修復后期，可以通過pH值調節或加入一定量的卡那霉素抑制該菌株生長，以免對環境造成二次污染．因此，可以利用菌株D61進行后續環境甾類化合物污染的修復．

參考文獻

［1］邵曉玲，馬軍，文剛．松花江流域某自來水廠中內分泌干擾物的調查［J］．環境科學，2008，29(10):2723－2728．

［2］沈劍，王欣澤，張真，等．羅時江中5種環境內分泌干擾物的分布特征［J］．環境科學研究，2012，25(5):497－500．

［3］陳明，楊小麗，沈丹群，等．長江中下游某Unitank污水處理廠去除雌激素的效果分析［J］．環境工程，2012，30(2):1－5．

［4］于源華，宋禹，何秀霞，等．環境中甾體激素降解菌的篩選及功能基因的克隆［J］．長春理工大學學報(自然科學版)，2010，33(1):108－111．

［5］戴藝民，周以飛，陳建秋，等．睪丸酮叢毛單胞菌工程菌構建及穩定性分析［J］．農業生物技術學報，2010，18(4):807－814．

［6］陶玉貴，王其進，谷浩，等．哈夫尼菌降解毒死蜱條件的優化及動力學模型建立［J］．農業環境科學學報，2011，30(3):449－454．

［7］戴藝民，潘大仁，XIONGGM，等．睪丸酮叢毛單胞菌活化因子基因的質粒載體構建及表達［J］．農業生物技術學報，2006，14(3):416－422．

［8］陳建秋，潘大仁，艾育芳，等．睪丸酮叢毛單胞菌teiR基因插入失活突變體構建及降解特性分析［J］．應用與環境生物學報，2009，15(6):830－834．

［9］孫會忠，王小東，宋月芹，等．產普魯蘭酶菌株ZXYG5的分離鑒定及其普魯蘭酶活性［J］．福建農林大學學報(自然科學版)，2015，44(6):629－633．

作者：林龍云 于曙光 柯蘭蘭 潘大仁 單位：福建農林大學生命科學學院 福建福州青島農業大學化學與藥學院