本站小編為你精心準備了綠膿桿菌菌劑介質的選擇參考范文，愿這些范文能點燃您思維的火花，激發您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

《福建農林大學學報》2016年第3期

摘要:

為將銅綠假單胞菌應用于重金屬污染環境的生物修復，以硅藻土(1～3mm)、硅藻土(3～6mm)、活性炭和輕石為材料，通過測定不同材料的吸水率、菌體吸附與釋放作用及制備菌劑的活菌數，篩選出適宜的菌劑載體．結果表明，在設定的載體濃度下(0～20g·L－1)，不同載體的菌體去除率隨濃度提高而增大，Q值在4．90%～49．60%之間;載體負載量隨濃度提高而減小，L值在923．33～82．83mg·g－1之間;硅藻土、活性炭的Q值在30min達到最大．硅藻土(1～3mm)、硅藻土(3～6mm)、活性炭和輕石的吸水率依次為60．3%、43．3%、23．4%和33．1%;以上4種載體制備的菌劑(菌劑A、B、C和D)的活菌釋放率依次為27．4%、28．8%、19．7%和37．1%．室溫保存30d后，菌劑A活菌數為6．25×108CFU·g－1，減少了78．4%，菌劑B活菌數為1．12×1010CFU·g－1，是初始值的5．38倍，菌劑C的活菌數為2．95×108CFU·g－1，減少了73．9%，菌劑D的活菌數為3．61×109CFU·g－1，增殖了127．0%．可見，載體濃度及吸附時間顯著影響其對菌體的吸附作用，3～6mm硅藻土的負載量適中，菌體存活率高，活菌釋放率高，可作為銅綠假單胞菌的菌劑載體．

關鍵詞:

銅綠假單胞菌;菌劑;載體;硅藻土;活性炭;輕石;吸附作用

農田土壤重金屬污染問題已引起人們的高度重視，研制微生物菌劑用于污染土壤的修復，可有效降低農產品安全風險，促進農田可持續經營．假單胞菌是廣布于自然環境中的革蘭氏陰性菌，具有氧化降解生物表面活性劑等作用，能在碳氫化合物、多氯聯苯等污染的環境中存活［1－4］，還可通過外排泵及細胞內的氧化還原酶系統對重金屬產生抗性，具有重金屬污染修復潛力［5－7］．銅綠假單胞菌是一種眾所周知的植物根際促生菌，具有根際集群能力強、世代時間短、易于遺傳操作、能夠產生鐵載體、分泌植物抗病物質及生長調節物質等作用，已被廣泛用作生防菌［8，9］．一些研究表明，銅綠假單胞菌具較強的重金屬耐性和富集能力［10，11］，具有一定的重金屬生物修復潛力;且有研究表明，芽孢桿菌制成的顆粒狀菌劑已用于廢水中金屬離子的回收［12］;酵母菌R32經凝膠海藻酸鈉包埋固定后可較好地去除水中六價鉻［13］．通過選擇適當的載體，將具有根際促生作用的銅綠假單胞菌制成菌劑并用于農業重金屬污染修復，可為農產品安全生產提供技術支持．現有可供選擇的菌劑載體種類繁多、性能各異，以硅藻土最為常見，活性炭和輕石等載體亦具良好的吸附性能［14－20］．硅藻土對水中Cd2+、Pb2+具有較好的吸附效果［21］，已有用做熒光假單胞菌P13菌劑的載體的研究報道［22］;活性炭是重金屬的常用吸附劑［23］;輕石具有一定吸附能力并被用做光催化載體［24］，經赤泥改性的浮石吸附劑可去除水體中的砷［22］;周鐵海等［25］也以浮石為載體，制備了La3+和Fe3+摻雜TiO2的復合光催化劑，用于去除污水中的TOC．目前，有關農田重金屬污染修復微生物菌劑的研究極少，本課題組前期從水稻根際土壤分離出一株具有良好的鎘富集能力的銅綠假單胞桿菌，該菌株對水稻生長有一定的促進作用．本研究通過評價硅藻土、活性炭及輕石作為菌劑載體的吸附作用、吸水率及其制備菌劑的有效菌體的釋放率、菌體存活率等，篩選出合適的菌劑載體，為銅綠假單胞桿菌菌劑的開發與應用提供依據．

1材料與方法

1．1試驗材料載體材料硅藻土和輕石均購買自上海秋草園藝設備有限公司，硅藻土A的粒徑為1～3mm，硅藻土B的粒徑為3～6mm，呈灰白色，質地較軟，質量輕，具有含大量微孔，空腔和通道的復雜結構;輕石又稱浮石或浮巖，質量輕，能浮于水，多孔，表面粗糙，吸附能力較強．顆粒狀活性炭購買自上海展云化工有限公司，黑色顆粒狀，具多孔結構，比表面積約1000m2·g－1．各載體材料經過兩次高壓滅菌(121℃，30min)、烘干后備用．供試銅綠假單胞桿菌菌株為課題組分離出的耐鎘菌株(甘油保存，－80℃超低溫冰箱)，菌株采用牛肉膏蛋白胨液體培養基活化、培養，培養基pH7．2，培養溫度37℃．

1．2試驗方法

1．2．1載體對菌體的吸附作用在無菌條件下，分別將0．1、0．2、0．4、0．8、1．2、1．6和2．0g載體加人到裝有90mL牛肉膏蛋白胨液體培養基的250mL錐形瓶中，保持37℃，pH=7．2，混勻，然后加入10mL培養24h的菌懸液，在恒溫搖床上吸附30min，測定不同載體的菌體去除率Q和載體負載量L［22］．Q(%)=(C－C')/C×100，菌體質量以細胞濕重計算，C、C'分別為吸附前后溶液中菌體的質量濃度(mg·L－1);L(mg·g－1)=(C－C')/C0，C0為載體用量(g·L－1)．同時，分別稱取1．0g不同載體，加入100mL的菌液中，設置載體濃度為10g·L－1的處理，在吸附的5，10，15，20，25，30min，分別測定菌體去除率Q和載體負載量L，分析兩者隨時間的變化．各處理設3次重復．

1．2．2不同載體吸水率的測定稱取載體材料100g，在無菌條件下，加入無菌水，混勻并使載體材料濕潤，保持疏松、不結塊，吸水率以100g載體所含的液體量表示，各處理3次重復．

1．2．3菌劑的制備及其有效菌體釋放率的測定稱取等量的硅藻土A、硅藻土B、活性炭、輕石于小燒杯中，經兩次高壓滅菌，每次121℃處理30min，65℃烘干備用;在無菌條件下，根據4種載體材料的吸水率加入銅綠假單胞菌菌液，混勻并保持載體材料濕潤、疏松、不結塊，制成菌劑．制備的菌劑依次命名為菌劑A、菌劑B、菌劑C和菌劑D，并放置在陰涼處室溫保存．保存2d后分別取0．1g菌劑加入到盛有100mL無菌水的250mL錐形瓶中，37℃恒溫搖蕩2h后，立即稀釋涂布，測定有效菌體釋放率，各試驗3次重復．有效菌體釋放率(%)=釋放細菌密度/接種細菌密度(CFU)×100%［22］．

1．2．4菌劑中菌體存活率的測定在菌劑室溫保存的2、7、14和30d，分別稱取0．1g菌劑，加人到盛有100mL無菌水的250mL錐形瓶中，恒溫搖蕩培養2h后進行稀釋涂布，測定活菌數，菌體存活率用測定值與初始菌數的比值表示，試驗3次重復．

1．2．5數據處理與統計分析數據處理采用MicrosoftExcel軟件進行，統計分析采用DPSV7．05和SPSS17．0系統軟件，樣本平均數的差異顯著性比較采用LSD法進行．

2結果與分析

2．1載體濃度對吸附效果的影響由圖1可見，不同的載體菌體去除率Q均隨載體用量的增加而增大．在載體濃度小于2g·L－1時，活性炭的菌體去除率最高(11．2%);在濃度為4g·L－1時，Q值為:硅藻土A(18．5%)＞活性炭(14．4%)＞硅藻土B(11．7%)＞輕石;在濃度大于4g·L－1時，菌體去除率為:硅藻土A＞硅藻土B＞活性炭＞輕石．在載體濃度為20g·L－1時，4種載體對銅綠假單胞桿菌的去除能力分別為49．60%、41．57%、36．02%、19．40%．載體負載量L隨載體濃度的增大而減小(圖1)，在載體濃度小于4g·L－1時，L值為:硅藻土A＞活性炭＞硅藻土B＞輕石;在濃度大于4g·L－1時，L值為:硅藻土A＞硅藻土B＞活性炭＞輕石;在濃度為20g·L－1時，4種載體的L值分別為373．3、217．7、162．3、82．8mg·g－1．

2．2吸附時間對吸附效果的影響由圖2可見，在0～5min，4種載體對銅綠假單胞桿菌的吸附速率較高，Q值為:活性炭(26．4%)＞硅藻土A(21．4%)＞硅藻土B(17．4%)＞輕石(16．6%);負載量L值為:硅藻土A(211．7mg·g－1)≈活性炭(194．6mg·g－1)≈硅藻土B(142．3mg·g－1)＞輕石(129．4mg·g－1)，前三者無顯著差異．隨著吸附時間的增加，載體的吸附速率明顯下降，負載量逐漸增大．在處理30min時，吸附基本達到平衡，以硅藻土A的菌體去除率和載體負載量最大，硅藻土A、硅藻土B、活性炭及輕石的Q值依次為:48．1%、40．8%、43．0%、33．1%，L值依次是470．6、332．6、294．6、255．4mg·g－1．

2．3不同載體材料的吸水率和有效菌體釋放率由表1可見，不同載體的吸水率存在顯著差異，不同載體的吸水能力為:硅藻土A＞硅藻土B＞輕石＞活性炭．活性炭有效菌體的釋放率為19．7%，兩種規格的硅藻土的有效釋放率沒有顯著差異，分別為27．4%、28．8%，輕石的有效釋放率為37．1%，輕石、硅藻土均具有良好的釋放作用．

2．4不同菌劑的活菌數在室溫條件下，不同菌劑中的銅綠假單胞桿菌存活數量存在顯著差異，且隨保存時間的變化而變化(圖3)．在試驗的保存時間內，菌劑A和菌劑C中的活菌數小于初始值，菌劑B和菌劑D中的活菌數大于初始值．由表1可見，不同菌劑接種后的活菌數量為:菌劑A(2．90×109)＞菌劑B(2．08×109)＞菌劑D(1．59×109)＞菌劑C(1．13×109)，在保存30d后，菌劑A活菌數為6．25×108CFU·g－1，減少了78．4%，菌劑B活菌數為1．12×1010CFU·g－1，是初始值的5．38倍，菌劑C的活菌數為2．95×108CFU·g－1，減少了73．9%，菌劑D的活菌數為3．61×109CFU·g－1，增殖了127．0%．

3結論與討論

通過比較不同材料及其制備菌劑的性能，發現3～6mm硅藻土的吸附與釋放能力均較好，制備的菌劑菌體的存活率高，可用于制備銅綠假單胞菌菌劑．3～6mm硅藻土制備的菌劑保存30d時的存活率高達540．6%，表明該載體的孔隙結構等有利于菌株的生長，每g菌劑含菌量為1．12×1010CFU，略高于馬榮梅等［26］在最優條件下制備的菌劑的含菌量．3～6mm硅藻土制備的菌劑室溫下保存至30d的含菌量高于1～3mm硅藻土的，這可能與較大粒徑的硅藻土具有的微孔、空腔和通道結構，更適合菌體存活與增殖．本研究篩選的菌劑載體為單一載體，選擇的硅藻土、活性炭及輕石均為常見材料，硅藻土的成本相對也較低，制備的菌劑性能較好，具有一定的應用前景．然馬榮梅等［26］研究發現，對于液體XM菌劑，混合載體比單一載體的吸菌效果更好，更適合微生物的生長繁殖，葉峰等［27］則將具高效降解三苯類物質能力的活性污泥，進一步在由麥麩、紅木屑、硅藻土組成的特定載體上發酵擴大培養，制成了復合菌劑．本試驗對銅綠假單胞菌菌劑載體材料的可行性及其性能進行了初步研究，關于混合載體或專用載體的篩選以及復合菌劑的制備等還有待深入研究，在本研究的基礎上，有望為進一步提高菌劑的性能奠定基礎．

參考文獻

［1］周麗英．水稻根際土壤耐鎘細菌的篩選及其耐鎘機理研究［D］．福州:福建農林大學，2012．

［2］邱小香，朱海燕．水體重金屬的污染及其處理方法［J］．湖南農業科學，2011，14:34－35．

［3］關小桃．突發性重金屬廢水污染事故處理菌劑的開發［J］．中國化工貿易，2013，6:325－327．

［4］魯光輝，鄭水林，王騰宇．硅藻土在廢水中的應用及研究現狀［J］．中國非金屬礦工業導刊，2012，34(3):39－43．

［5］徐建軍，張傳順，管繼南．硅藻土的應用及研究進展［J］．廣西輕化工，2011，35(5):23－24．

［6］盧敬科．改性活性炭的制備及其吸附重金屬性能的研究［D］．杭州:浙江工業大學，2009．

［7］施紅，努爾東拜，吳云海，等．活性炭吸附法去除廢水中重金屬的研究進展［J］．江蘇環境科學，2006，19(2):110－113．

［8］王慧敏．赤泥改性浮石吸附劑對水體中砷去除規律的研究［D］．云南:昆明理工大學，2014．

［9］凌靜．硅藻土對廢水中Cd2+和Pb2+的吸附性能研究［D］．衡陽:南華大學，2013．

［10］李慧，王平，肖明．硅藻土和滑石粉作為熒光假單胞菌P13菌劑的載體研究［J］．中國生物防治，2009，25(3):239－244．

［11］袁磊．浮石及其載輕基化鋅催化臭氧氧化對氯硝基苯的研究［D］．哈爾濱:哈爾濱工業大學，2013．

［12］周鐵海，趙玲，尹平河．La3+和Fe3+共摻雜TiO2/浮石的制備及光催化礦化二級出水效果［J］．生態環境學報，2009，18(5):1721－1726．

［13］馬梅榮，陳雷，宣世偉，等．XM固態菌劑載體選擇的初步研究［J］．哈爾濱工業大學學報，2005，37(2):259－262．

［14］葉峰，張麗麗，吳石金，等．降解三苯類復合微生物菌劑的制備及性能［J］．中國環境科學，2009，29(3):300－305．

作者：王微 李圓萍 謝惠玲 肖清鐵 鄭梅琴 陳燊 何小三 鄭新宇 林瑞余 林文雄 單位：福建農林大學生命科學學院農業生態研究所