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摘要:目的篩選乳腺癌的候選治療藥物，為乳腺癌治療藥物的研究與開發提供參考。方法從NCBI中的GEO數據庫中搜集與乳腺癌相關的基因表達數據，將乳腺癌樣本與正常乳腺組織進行對比，GEO2R篩選差異表達基因，并通過CMAP工具分析差異表達基因，篩選乳腺癌候選治療藥物。采用生物信息學方法分析乳腺癌候選治療藥物的靶基因，研究藥物治療乳腺癌的分子機制。結果篩選得到了以白藜蘆醇、芹黃素、棉酚為代表的抗腫瘤類藥物，以及激素類、抗菌類等候選治療藥物。結論篩選得到的藥物有望成為乳腺癌的候選治療藥物，為乳腺癌治療的臨床研究提供理論基礎。對部分候選藥物的抗乳腺癌機制的研究結果，為乳腺癌靶向治療提供了新的參考方向。

關鍵詞:乳腺癌；治療藥物；分子機制；生物信息學；基因表達譜

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，發病率和死亡率居婦女各類惡性腫瘤之首，嚴重威脅著女性的身體健康[1]。近年來乳腺癌的治療手段不斷發展，手術治療、化學治療、靶向治療等多種臨床治療手段已經日趨成熟，但由于乳腺癌本身具有高度異質性[2]及易轉移性等特點，乳腺癌患者的死亡率仍然得不到有效的控制。因此，篩選更有效的乳腺癌治療藥物，延長病人的生存期和降低乳腺癌的死亡率，具有重要意義。傳統的藥物研發是一個復雜而漫長的過程，需要耗費大量的人力物力，才能找到較為行之有效的候選藥物。基因表達譜芯片可以同時觀察成千上萬個基因在不同個體、不同組織、不同發育階段的表達狀況[3]，根據基因在不同條件下的表達差異性來進行藥物篩選，可為藥物研發提供方向，加快藥物的發現。因此，本文采用生物信息學方法對乳腺癌相關基因表達譜數據進行挖掘分析，篩選乳腺癌候選治療藥物，并對篩選得到的候選藥物進行生物學通路、作用靶點等分析，研究其分子機制，加快乳腺癌藥物研發的進程，為乳腺癌臨床治療研究提供理論參考。

1數據集

本文研究所用的乳腺癌基因表達譜數據來自于NCBI的GEO數據庫的GPL570平臺，包括GSE29044、GSE42568、GSE9309和GSE50428。其中，GSE29044包括73個乳腺癌組織與36個正常乳腺組織，共109個樣本；GSE42568包括104個乳腺癌組織與17個正常乳腺組織，共121個樣本；GSE9309包括128個乳腺癌組織與9個正常乳腺組織，共137個樣本；GSE50428包括26個乳腺癌組織與5個正常乳腺組織，共31個樣本。

2方法與結果

2.1篩選差異基因

GEO2R[4]是一個在線的芯片分析工具，可用于比較兩組或多組樣品的差異表達基因。本文采用GEO2R對前述4個樣本集分別進行基因差異表達分析，將樣本分為正常組與癌癥組，以P值小于0.01篩選得到差異基因，根據篩選所得差異基因對應的LogFC值，大于2的即為上調基因，小于－2的即為下調基因。對4個樣本集的差異基因取交集，獲得共同差異表達基因138個，其中上調表達基因12個，下調表達基因126個(見表1)。

2.2CMAP篩選候選治療藥物

為了篩選有價值的乳腺癌候選治療藥物，采用ConnectivityMap[5]對上述共同差異基因進行分析，在基因水平上對藥物進行篩選。CMAP是一個藥物作用基因表達數據庫，搜集了大量小分子藥物處理過的腫瘤細胞表達譜的變化模式。CMAP可通過比較正常樣本與腫瘤樣本的基因表達差異，基因富集分析算法得到相關藥物，當富集分數為負數時，意味著此藥物能夠反向作用于差異表達模式，以此篩選與腫瘤相關的藥物。以乳腺癌差異表達基因為querysignature，與CMAP數據庫中的藥物基因表達譜數據進行配對，篩選得到的藥物相關實驗次數越多，負性富集分數越高，其與乳腺癌的相關性越強。按實驗次數大于3，富集分數小于－0.5進行篩選，得到100多個相關藥物，這些藥物可較好地逆轉乳腺癌的基因表達譜。篩選得到的候選治療藥物中，部分藥物為已知抗腫瘤藥物(見表2)，其中甲氨蝶呤是已知明確的乳腺癌治療藥物，說明了篩選結果的可靠性。此外，篩選得到的藥物還包括有激素類藥物，如甲羥孕酮、左炔諾孕酮等；抗菌類藥物，如克霉唑、硫鏈絲菌肽等；抗病毒類藥物，如三氟尿苷、阿糖腺苷等；抗組胺類藥物，如地普托品等；心血管類藥物、抗抑郁類藥物等。篩選得到的候選治療藥物中，已知的具有抗腫瘤作用的藥物應為后期研究的重點。本文從實驗次數、富集分數、已知抗腫瘤作用等多方進行比較，首先選擇了白藜蘆醇、芹黃素、棉酚3個藥物進行其抗乳腺癌分子機制的研究。其中，白藜蘆醇和芹黃素已有報道其干預乳腺癌細胞的實驗研究，但并未成為正式的乳腺癌治療藥物；而棉酚則只報道了抗其他腫瘤的作用。本文采用生物信息學方法，分析這些藥物的靶蛋白及其與乳腺癌相關基因的相互關系，研究其治療乳腺癌的分子機制，為藥物治療乳腺癌提供理論依據，也為其他藥物的進一步分析和篩選提供思路。除了表2中的已知抗腫瘤藥物，候選治療藥物中的其他類藥物也同樣具有可能的抗乳腺癌作用。部分糖皮質激素和雌激素已被證明有抗腫瘤活性，其中甲羥孕酮是明確的乳腺癌治療藥物。抗菌類藥物可通過干擾和抑制細胞的生長繁殖過程而殺滅細菌和病原微生物，而近年來研究發現，抗生素對于癌細胞也具有相同作用，對有癌變趨勢的細胞使用抗生素，可抑制癌細胞的生長與擴散，表現出抗癌活性。抗病毒藥物可用于治療或輔助治療惡性腫瘤，而抗組胺藥能夠干擾髓源性抑制細胞的功能，亦有可能成為候選抗癌藥。心血管類藥物目前沒有發現有直接的抗癌作用，可能是因為某些癌癥治療藥物具有心血管毒性，引發心血管并發癥從而使癌癥病人的基因表達譜與心血管類藥物的治療譜類似；抗抑郁類藥物亦可同理解釋，這兩類藥物具有抗癌活性的可能性相對較小。

2.3候選藥物抗乳腺癌機制分析

2.3.1藥物的靶蛋白在NCBI的PubChemCompound[6]中，分別搜索白藜蘆醇、芹黃素、棉酚的靶蛋白，白藜蘆醇得到NQO2等95個靶蛋白，芹黃素得到ESR1等48個靶蛋白，棉酚得到THRB等50個靶蛋白。在Genecard[7]數據庫中尋找已知與乳腺癌相關基因，得到了BRCA1等308個乳腺癌相關基因。

2.3.2靶蛋白String分析String[8]是1個由已知或預測的蛋白質相互作用數據組成的數據庫(基因則被識別為相應的編碼蛋白質)，它主要用于構建蛋白質相互作用網絡，并通過聯合其他平臺進行GO和KEGG富集等分析，有助于挖掘核心的調控基因。分別對各藥物的靶蛋白以及乳腺癌相關基因進行String分析，尋找各藥物靶蛋白與乳腺癌相關基因之間的共同KEGG通路和位點，結果見表3。共同通路可以反映藥物發生治療作用的生物通路，共同位點則應為藥物可對乳腺癌發生作用的關鍵靶蛋白，如白藜蘆醇可能通過作用于AKT1、TP53、PTGS2等位點來發生抗乳腺癌作用。表3中共同位點包括有，BRCA1、ESR1等典型乳腺癌基因，說明了本文篩選候選治療藥物結果的合理性，其他位點則為乳腺癌靶向治療提供了新的參考方向。靶向治療特異性強，效果顯著，針對乳腺癌發生、發展有關的信號通路進行靶向藥物的開發與臨床應用亦是乳腺癌治療研究的熱點[9]。Cytoscape[10]是1個生物網絡的綜合分析和可視化工具，它的中心組織原則是1個網絡圖，其中生物實體(如基因、蛋白質等)為節點，生物相互作用表示為節點之間的邊。采用cystocape軟件對各藥物的靶蛋白相互作用網絡進行可視化及拓撲結構分析，分析網絡中的中心節點(度數和介數高的基因)，結果見圖1和表4。這些網絡中心節點在網絡中起到關鍵調控作用，部分與表3中的關鍵靶蛋白重合，進一步說明了這些靶蛋白的重要性；而與關鍵靶蛋白未發生重合的網絡中心節點，則應是通過調控關鍵靶蛋白而間接實現藥物作用。

3小結

本文采用生物信息學方法，從GEO數據庫中收集與乳腺癌相關的基因表達譜數據并進行分析，篩選乳腺癌候選治療藥物。篩選得到的藥物主要包括有以白藜蘆醇、芹黃素、棉酚為代表的抗腫瘤類藥物，還包括激素類、抗菌類等藥物，這些藥物可較好地逆轉乳腺癌的基因表達譜，有望成為乳腺癌的候選治療藥物或輔助治療藥物，對乳腺癌的治療研究具有重要意義。此外，本文還對白藜蘆醇、芹黃素和棉酚進行了藥物抗乳腺癌機制的研究，分析藥物治療乳腺癌的作用靶點，為乳腺癌靶向治療提供了新的參考方向。

參考文獻:

[2]李海飛.化療對三陰性乳腺癌CD44~＋CD24~(￣/low)亞群影響的實驗與臨床研究[D].河北:河北醫科大學，2011.

[3]王亮亮，朱忠政，徐菊英，等.基于基因表達譜的肝細胞癌過表達基因篩選[J].臨床腫瘤學雜志，2017，22(7):613￣616.

[6]劉海波，彭勇，黃璐琦，等.基于PubChem數據庫的天然產物快速尋靶方法[J].中草藥，2012，43(11):2099￣2106.

[8]上官輝.肝癌易感相關基因及組織基因表達譜生物信息學分析[D].廣州:南方醫科大學，2015.

[9]甘紹舉，王青，朱麗敏，等.靶向治療藥物在乳腺癌中的研究進展[J].基礎醫學與臨床，2015，35(1):134￣137.

作者：廖思帆 吳麗媛 梁碧怡 李煥丹 周漩 單位：廣東藥科大學藥學院