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摘要：

動物形態(tài)的多樣性造就了豐富多彩的動物世界.脊椎動物附肢形態(tài)的發(fā)生一直以來是研究物種形態(tài)進化發(fā)育的典型例子.脊椎動物的附肢在漫長的進化歷程中發(fā)生了多次重大的改變,這大大提高了脊椎動物的適應(yīng)性.另外,在由水生鰭向陸生足演化以及四足動物形態(tài)各異的四肢發(fā)育過程中,涉及很多與發(fā)育相關(guān)的基因和調(diào)控通路.本文結(jié)合發(fā)育生物學(xué)和遺傳學(xué)的證據(jù),綜述了近年來對脊椎動物四肢發(fā)育及進化機制的相關(guān)研究,強調(diào)了基因的時空差異表達及調(diào)控是造成生物形態(tài)適應(yīng)性進化的主要驅(qū)動力.

關(guān)鍵詞：

脊椎動物；附肢發(fā)育；附肢進化；適應(yīng)性進化；信號通路

脊椎動物在由水生到陸生的進化過程中,其賴以運動的附肢經(jīng)歷了由成對的鰭向四肢的變化,再由四肢到翅膀的演變,甚至是喪失了四肢(如蛇和鯨)的演變等一系列過程.這一復(fù)雜的四肢演變過程使脊椎動物能很好地適應(yīng)水、陸、空三大生態(tài)位.所以,從骨骼發(fā)育和進化起源來看四足動物的前后肢與魚的胸鰭和腹鰭是同源的,但在功能上卻發(fā)生了適應(yīng)性輻射進化[1],這種同源卻不同功能的例子還有同屬哺乳類的蝙蝠的翼手和人的手.于是,關(guān)于脊椎動物四肢是如何進化和發(fā)育的問題一直被人們所關(guān)注.從20世紀末開始,人們對進化過程中形態(tài)的改變和發(fā)育過程之間的聯(lián)系甚是感興趣[2].而脊椎動物的四肢是研究發(fā)育過程中形態(tài)發(fā)生以及它們最早是如何從軟骨魚類進化而來的良好模型[3].近年來,比較發(fā)育生物學(xué)、比較基因組學(xué)以及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的研究興起,可以通過對比同源發(fā)育基因在不同物種之間的差異表達模式,以及相關(guān)信號通路上的基因差異表達來揭示脊椎動物四肢進化發(fā)育的分子機制[4,5].本文結(jié)合發(fā)育生物學(xué)和分子生物學(xué)研究進展,一方面闡述了脊椎動物四肢從側(cè)芽到有功能四肢的發(fā)育過程,是由相同的發(fā)育模式和基因信號途徑調(diào)控的;另一方面通過分析脊椎動物在四肢進化過程中發(fā)生一系列形態(tài)轉(zhuǎn)變的成因,表明最終發(fā)育為不同形態(tài)和功能的四肢則是由發(fā)育相關(guān)基因的差異表達所致.進一步強調(diào)了多學(xué)科的交叉研究以及更多不同物種的基因組和轉(zhuǎn)錄組的解析,是將來對非模式生物的形態(tài)發(fā)育及進化的研究趨勢.

1脊椎動物附肢發(fā)育的研究進展

脊椎動物的附肢在形態(tài)和功能上表現(xiàn)出系統(tǒng)多樣性:強健的四肢行走奔跑于陸地山野間、矯健的翅膀飛行穿梭于天宇叢林間、靈動的魚鰭暢游河流海洋間.但是附肢發(fā)育的基本形態(tài)發(fā)育模式是保守一致的,主要可分為近遠軸(proximal-distal,肱骨到掌骨),前后軸(anterior-posterior,拇指到小指)和背腹軸(dorsal-ventral,手背和手心)[6,7],見圖1(a).附肢的發(fā)育都是由側(cè)板中胚層的側(cè)芽發(fā)生開始[8,9],具體表現(xiàn)為:側(cè)板中胚層細胞增殖形成側(cè)肢芽,隨后外胚層細胞沿著肢芽邊緣形成頂外胚脊(apicalectodermalridge,AER);AER分泌纖維生長因子(Fgfs)到間充質(zhì)細胞,使肢芽進一步生長[10],最后從3個軸發(fā)育成不同形態(tài)的附肢.因此,調(diào)控附肢發(fā)育的分子機制也是保守的,主要涉及Fgfs,Wnts,Shh,RA和Bmps等信號通路.這些通路主要是與軟骨增生和分化的調(diào)節(jié)有關(guān)[11].

1.1Fgfs,Wnts信號通路調(diào)控附肢側(cè)芽的發(fā)生

側(cè)芽的發(fā)生主要涉及T-box轉(zhuǎn)錄因子Tbx5和Tbx4以及纖維生長因子Fgfs8和Fgfs10正確表達在側(cè)板中胚層,產(chǎn)生附肢芽.在敲除Tbx5的小鼠中,其前肢芽無法形成[12],同樣在雞胚中抑制Tbx5和Tbx4的表達,則會形成無附肢的雞胚[13].另外,在肢芽形成時如果FGF8沒有活性,那么形成的肢芽會很小[10],而FGF10在斑馬魚的胸鰭和雞的前肢肢芽形成中維持了Tbx5的表達[14].而這些影響附肢芽形成的基因的正確表達主要由Fgfs,Wnts信號通路調(diào)控,詳情見圖1(b).

1.2RA,Fgfs信號通路調(diào)控附肢近遠軸的發(fā)育

附肢前后軸包括近肢體端的肱骨,中段的橈骨和尺骨以及遠端的掌骨和指骨.那么在發(fā)育過程中生物個體如何控制從肱骨向指骨的發(fā)育轉(zhuǎn)變?四肢的形成主要經(jīng)歷了軟骨細胞增生、凋亡和骨節(jié)生成的階段[1,8].在此過程中,Bmp和Sox9影響軟骨細胞增殖與富集,如果形成的軟骨細胞較少,發(fā)育形成的四肢則較短[8].Wnts信號通路是細胞增殖所必需的,并且負調(diào)控軟骨生成[15].近遠軸的三段骨節(jié)的形成主要是由RA/FGF的表達比例決定的.隨著RA和FGF表達的比例下降,附肢傾向于由肱骨向橈骨和尺骨轉(zhuǎn)變;隨后在較低的RA/FGF的比例下,HoxA13基因被激活,形成掌骨和尺骨[3,16],見圖1(c).因此,脊椎動物的附肢從肱骨到指骨的近遠軸的發(fā)育是由多條信號通路相互調(diào)節(jié)決定的.

1.3Shh,Bmps信號通路調(diào)控附肢前后軸的發(fā)育

脊椎動物前后軸的確定源于肢芽形成時,Shh在肢芽后側(cè)區(qū)域特異表達[17],而Sox9,Gli3和Hand2是確保Shh正確表達于肢芽后側(cè)的關(guān)鍵基因[18,19],見圖1(d).Gli3于肢芽前側(cè)表達,而Hand2表達在肢芽后側(cè)[18],二者相互抑制呈現(xiàn)出表達的極性.研究表明,Gli3是Shh的抑制因子,對指骨的特化和數(shù)目起決定性作用,當Gli3被抑制后,小鼠則出現(xiàn)嚴重的多趾現(xiàn)象[20].此外,Bmp信號通路中Sox9和Bmpr1b的表達,使得軟骨凝聚,形成指骨,最后GDF5介導(dǎo)指節(jié)形成[21].而且基因在正確的發(fā)育時期的正確表達是附肢正常發(fā)育的前提,如:Bmp4在發(fā)育早期失活,則肢芽停止生長無法形成指節(jié);若在后期失活,則會出現(xiàn)多指(趾)現(xiàn)象[22].這表明,Shh和Bmp信號通路的正確調(diào)控是脊椎動物形成正常前后軸附肢的重要因素.

1.4Wnts信號通路調(diào)控附肢背腹軸的發(fā)育

脊椎動物附肢的背腹之分主要表現(xiàn)為四肢遠端指頭背部有指甲結(jié)構(gòu)而腹部則有較多的分泌腺分布.這種結(jié)構(gòu)上的差異主要是由上皮細胞和間質(zhì)細胞之間相互作用的結(jié)果[23].從分子層面上來看,主要是由于Wnts信號通路調(diào)控了基因的背腹極性表達,產(chǎn)生了附肢的背腹軸.附肢芽的背軸外胚層表達WNT-7a,進而調(diào)控lmx1b表達于背軸;在腹軸肢芽外胚層中則表達EN-1(由engrailed-1編碼表達),而且EN-1負調(diào)控WNT-7a的表達[23],見圖1(e).在小鼠中,wnt-7a和lmx1b的敲除,都能導(dǎo)致背軸組織結(jié)構(gòu)向腹軸結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化[23,24];同樣地,在engrailed-1功能散失的小鼠中,四肢的腹軸組織結(jié)構(gòu)向背軸組織結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化[25].因此,wnt-7a信號通路的表達調(diào)控是附肢背腹軸的正確分化的決定性因素.

2脊椎動物四肢進化的研究進展

在探討了脊椎動物的附肢是如何發(fā)育之后,那么相應(yīng)的問題油然而生:脊椎動物不同形態(tài)的附肢是如何進化而來的呢?它們進化的分子機制又是什么?我們主要從對稱鰭向四肢的演化和為適應(yīng)不同環(huán)境四足動物演化出不同形態(tài)的四肢兩個方面來剖析脊椎動物四肢進化的分子機制.

2.1基因的時空表達差異與對稱側(cè)鰭向四肢的演化

約在3億6千萬年前(360millionyears)[8],脊椎動物的祖先離開水面進化出了適應(yīng)陸生生存的四肢,四肢最早源于硬骨魚的兩側(cè)對稱鰭,而對稱鰭則是由中部背鰭(如七鰓鰻)演化而來[26].在對稱鰭的出現(xiàn)到向四肢演變過程中主要是由T-box基因、Hox基因和Shh在側(cè)芽不同部位的差異表達所致.在上文提及附肢側(cè)芽形成中也提到T-box基因?qū)η昂笾珎?cè)芽的形成起到關(guān)鍵作用.研究表明,在小鼠和斑馬魚胚胎中,Tbx5和Tbx4分別表達于形成前后肢的側(cè)板中胚層中[12,27].而文昌魚和七鰓鰻雖然都有Tbx5/4,但是在胚胎時期僅表達于背部中胚層而非側(cè)板中胚層,這與文昌魚和七鰓鰻只有背鰭而無側(cè)鰭的發(fā)育模式是一致的[28].同樣地,通過原位雜交比較發(fā)現(xiàn),Hoxd基因在軟骨魚類(如catshark)中和四足動物中有相同的時間表達模式:在肢芽發(fā)育早期階段(PhaseⅠ),Hox9表達于近端;而在后期(PhaseⅡ),Hox10-Hox13沿著遠端邊緣表達,表明Hox基因在附肢芽發(fā)育的時間表達模式是保守的,因此,Hox基因成員在特定發(fā)育時間的特定表達是附肢正常發(fā)育的基礎(chǔ).但是其在軟骨魚類肢芽上的表達區(qū)域要局限得多[29],導(dǎo)致四足動物四肢近遠軸的形成.這種基因的表達差異也存在于硬骨魚類和四足動物中,如HoxA11和HoxA13分別表達于四足動物四肢的近遠軸,但在斑馬魚的鰭芽中沒有類似的表達極性,而表現(xiàn)出重疊表達[30],因此魚鰭沒有明顯的近遠軸區(qū)別.另外,脊椎動物的四肢從鰭進化而來以后,在形態(tài)上的一大區(qū)別就是魚鰭無明顯的前后軸之分.鰭的內(nèi)部骨骼都是在同一平面上排列且骨骼較多,而陸生四足動物則有明顯的指骨骨骼分化,見圖1(a).Shh信號通路在四肢前后軸形成的過程中起關(guān)鍵作用[31].在非模式生物貓鯊(catshark)的研究中,對培養(yǎng)中的卵進行前后軸相關(guān)基因的原位雜交發(fā)現(xiàn):Shh信號通路上的2個標志性基因Ptch1和Hand2在鰭的前后端都有表達[32],因此貓鯊的鰭幾乎沒有前后端的分化;而在四足動物中Ptch1和Hand2僅表達于后端[7](圖1(d)),基因的這種區(qū)域性表達形成了四肢的前后軸發(fā)育模式.另外,基因在不同發(fā)育時期的表達及表達時間的長短也影響著附肢的形態(tài)發(fā)育.如小鼠的第三到第五指骨的發(fā)育取決于SHH表達的量和表達時間的長短,其第五指骨的形成需要SHH表達的時間最長[33].同樣地,在雞胚的不同發(fā)育時期抑制SHH的表達所生成的指骨數(shù)是不一樣的[34].因此,T-box,Hox和Shh基因在時空上的差異表達可能與硬骨魚類對稱鰭的發(fā)生有關(guān),同時也是對稱側(cè)鰭向陸生脊椎動物的四肢演變的重要因素.

2.2基因的表達水平差異與四肢的適應(yīng)性輻射

演化陸生脊椎動物的四肢形態(tài)多樣性呈現(xiàn)出適應(yīng)性進化:手、腳、爪子、翅膀,甚至是四肢退化等不同形態(tài).主要差異在于指骨的數(shù)目及指節(jié)長短的差異,在進化中這些差異的形成離不開對四肢發(fā)育起重要調(diào)控作用的信號通路及其基因.首先我們關(guān)注的是與指骨形成密切相關(guān)的Shh信號通路.在沒有四肢的爬行類(如:蛇)和兩棲類(如:蚓螈)中,Shh的增強子序列功能發(fā)生了退化[35];同樣的由于Shh的信號調(diào)控使得雞和鳥類的翅膀僅有3個指骨[34].除了兩爬類和鳥類,Shh信號通路對四肢發(fā)育的調(diào)控也見于哺乳動物中:比起小鼠,在僅有兩個指骨的豬和牛中,Ptch1在肢芽的后端表達量較低[36];而且海豚的后肢退化也是轉(zhuǎn)錄因子Hand2和Shh在后肢芽上無表達的結(jié)果[37].在哺乳動物中除了海豚和鯨類,四肢特化比較明顯的要數(shù)蝙蝠,而且近年來對蝙蝠四肢的進化發(fā)育研究也很多.以下就以蝙蝠為例,探討基因表達水平的差異如何調(diào)控脊椎動物的四肢形態(tài)進化.在現(xiàn)存的蝙蝠中,不同物種間的翅膀形態(tài)各異.無論是從翅膀的外部形態(tài)(翼尖形態(tài)、縱橫比大小)還是從內(nèi)部骨骼連接(有無指節(jié))來看,都有著明顯的差異,而這些差異可能與其不同的飛行環(huán)境和捕食策略有關(guān)[38,39].就形態(tài)而言,現(xiàn)生蝙蝠前肢的第Ⅰ和Ⅱ指節(jié)較短,第Ⅲ,Ⅳ及Ⅴ指節(jié)較長[40],而且指間的組織并沒有凋亡脫落,而是有一層富有彈性的肌肉組織組成為翼膜.蝙蝠指節(jié)的這種異常生長形態(tài),是由于生長板上的軟骨細胞的增殖、分化和減慢凋亡[41].從基因策略看,首先要抑制骨節(jié)形成,即抑制軟骨細胞凋亡.在骨節(jié)形成之前,蝙蝠在指節(jié)間表達GREM(Bmp抑制蛋白)以及FGF8抑制細胞凋亡;另外Fgf-Shh-bmp-Gremlin的反饋調(diào)節(jié)作用使得指間組織增生發(fā)育,最后肢長得到延伸[42].另一個策略就是增加軟骨形成蛋白的表達量,例如影響軟骨細胞增殖的Bmp2,Hoxd13和prx1在蝙蝠中表達顯著上調(diào).對比人和小鼠,這些基因在序列上高度保守,但是在蝙蝠中有較高的表達水平,這使得蝙蝠軟骨細胞大量增殖,最終導(dǎo)致指節(jié)變長[43~46].另外,Booker等人[47]在蝙蝠祖先基因組上發(fā)現(xiàn)了多個快速進化區(qū)域,這些快速進化區(qū)域與四肢發(fā)育基因(Twist2,Spry1,Shh,Spg20,Hoxd)在位置上相距較近,并認為這些區(qū)域?qū)φ{(diào)節(jié)四肢發(fā)育的基因有增強子的功能.因此,這些基因表達水平的上調(diào)使得蝙蝠進化出了與其他哺乳動物不同形態(tài)的四肢.蝙蝠的四肢除了進化出與其他哺乳動物有較大差異的翼手外,其自身的前后肢也有較大的差異,即后肢明顯比前肢短.從脊椎動物發(fā)育相關(guān)的信號通路[48]來看,這些通路中基因的活性和表達量在蝙蝠前后肢上也有區(qū)別,這可能與蝙蝠前后肢形態(tài)差異有關(guān).Wnt/β-catenin信號通路在前肢上受到抑制,此信號通路的作用是在軟骨發(fā)育過程中抑制間質(zhì)細胞的凝集,前肢此信號通路受到抑制后,大量的間質(zhì)細胞凝集并發(fā)育成翅膀.Bmps信號通路則有兩種模式:Bmps和Gremlin1在胚胎發(fā)育前期在后肢表達較高,而在胚胎發(fā)育后期則在前肢有較高的表達[5].對應(yīng)的,一些上述信號通路中的調(diào)控基因在前后肢上也有顯著的表達差異,如5ʹHoxd,Tbx3,Tbx5,Mut3和Lhx8僅表達于前肢而且表達量相對很高,尤其是在第Ⅲ和Ⅴ指節(jié)中有更高的表達水平;而Tbx4,Pitx1以及激活凋亡程序的Msx1和Msx2在后肢中表達較高[1,5,49].除調(diào)控基因外,先前的相關(guān)研究表明,一些長鏈非編碼RNA(LncRNAs)也與發(fā)育調(diào)控相關(guān)[50].在蝙蝠的四肢發(fā)育過程中,一些LncRNAs在蝙蝠中很保守而且在前后肢中存在表達差異,如Tbx5-as1在蝙蝠前肢中有較高的表達并影響前肢的發(fā)育[5].另外,基因調(diào)控區(qū)域的改變也會影響個體的形態(tài)發(fā)育[51],蝙蝠前肢中H3K27乙酰化水平較高,而后肢則H3K27甲基化水平較高[5].綜上所述,多因素調(diào)控下的基因表達水平差異是導(dǎo)致蝙蝠的前后肢呈現(xiàn)不同形態(tài)的主要驅(qū)動力.

3結(jié)論與展望

現(xiàn)今對脊椎動物四肢發(fā)育與進化的研究慢慢從經(jīng)典實驗胚胎學(xué)向分子生物學(xué)延伸,以及從模式生物向非模式生物的研究轉(zhuǎn)變.脊椎動物進化出不同形態(tài)的四肢,是由于基因在發(fā)育過程中的表達差異造成的.這些表達差異既包括基因區(qū)域性表達差異,也包括基因表達水平的差異.而這些差異是由復(fù)雜的調(diào)控途徑相互作用實現(xiàn)的,包括發(fā)育相關(guān)的信號通路、轉(zhuǎn)錄因子、基因組的調(diào)控區(qū)域以及一些有調(diào)控功能的LncRNAs等.對于脊椎動物附肢這個復(fù)雜性狀,從單個基因出發(fā)已經(jīng)不能全面解決問題.因此,從進化基因組學(xué)、比較基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)等多層次分析為系統(tǒng)揭示脊椎動物四肢如何進化提供可能.鑒于非模式生物的研究相對較困難而且單基因組分析顯得無規(guī)律性,那么需要研究大量的不同物種樣本以及更多的全基因組數(shù)據(jù),并通過進化生物學(xué)的理論來篩選可能影響四肢發(fā)育的基因,從而揭開動物形態(tài)多樣性分子機制之謎.

作者:祁飛燕 施鵬 單位:中國科學(xué)院昆明動物研究所進化與功能基因組學(xué)實驗室