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《貴州農業科學雜志》2014年第四期

1方法

1．1偶聯蛋白的制備采用雙交聯法制備偶聯蛋白［5］咖啡堿0．3mg溶于0．5mL0．6mol／LNaOH中，加入0．5mL2g／L硼氫化鈉，再加入偶聯劑進行活化，25℃振蕩4h，加入適量的Na2CO3使其終濃度為0．3mol／L，加入5mg載體蛋白，37℃偶聯反應24h，反應結束，加入過量的甘氨酸，進行封閉。將反應產物溶液過G－25層析柱進行純化，用0．01mol／LPBS（pH7．4）洗脫液洗脫，收集的第一個洗脫峰即為目標產物。同法制備EGCG偶聯蛋白。

1．2偶聯蛋白的檢測對制備的偶聯蛋白，采用HPLC進行檢測（色譜柱為G5000PWXL，流動相0．01mol／LPBS，流速0．8mL／min）以檢測經G－25凝膠分離純化后的偶聯物中是否含有游離的咖啡堿。

1．3偶聯蛋白的紫外光譜分析采用紫外可見分光光度計（UV－1800）進行紫外掃描記錄，測定咖啡堿、載體蛋白和偶聯蛋白的紫外吸收曲線。檢測波長270nm和278nm．

1．4偶聯蛋白中咖啡堿與載體蛋白偶聯比的測定采用紫外可見分光光度法對偶聯蛋白中咖啡堿與載體蛋白的摩爾比進行測定。測定咖啡堿、載體蛋白、偶聯蛋白在波長270nm和278nm的吸光度A，按公式ε＝A／bc計算咖啡堿和載體蛋白在這兩種波長下的摩爾吸光系數。其中，ε為摩爾吸光系數、b為液體厚度、c為咖啡堿和載體蛋白的濃度，根據所測定的載體蛋白在兩個波長的吸光度，以及咖啡堿和載體蛋白在這兩種波長下的摩爾吸光系數，計算出偶聯蛋白的偶聯比。計算公式：C咖啡堿／CBSA＝（A278×KBSA，270－A270×KBSA，278）／（A270×K咖啡堿，278－A278×K咖啡堿，270），其中，C咖啡堿／CBSA為咖啡堿－BSA分子中咖啡堿與BSA的偶聯比，A278、A270為其在波長278nm和270nm的吸光度，KBSA，270、KBSA，278、K咖啡堿，278和K咖啡堿，270為咖啡堿和BSA在這二種波長下的摩爾吸光系數。同法測定EGCG偶聯蛋白的偶聯比。

1．5間接ELISA操作流程按照免疫學實驗方法進行ELISA操作［6］，測定OD值。每個步驟之間均用洗滌液洗滌3次，每次洗3min；每種試劑加入的體積均為100μL。在OD值接近1．0時，以P／N值在2．0以上并呈現最大者的反應條件作為確定ELISA反應條件的參考依據。

1．6咖啡堿偶聯蛋白最佳包被濃度的確定采用方陣滴定法，將咖啡堿偶聯蛋白分別稀釋成8μg／mL、4μg／mL、2μg／mL、1μg／mL、0．5μg／mL和0．25μg／mL，包被。以OD值接近1．0時，且P／N值在2．0以上并呈現最大者為最佳包被濃度。

1．7咖啡堿偶聯蛋白最佳包被時間和溫度的確定以咖啡堿偶聯蛋白最佳包被濃度包被板子，按37℃4h、37℃4h后4℃過夜、37℃2h后4℃過夜、4℃過夜分別包被，以OD值接近1．0時，且P／N值在2．0以上并呈現最大者為最佳包被時間和溫度。

1．8EGCG偶聯蛋白最佳工作濃度的確定將EGCG偶聯蛋白分別作1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000倍稀釋，測定其OD值。以OD值接近1．0時，且P／N值在2．0以上并呈現最大者為最佳工作濃度。

1．9咖啡堿與茶多酚EGCG反應最佳時間的確定作用時間分別設為30min、40min、60min和80min，測定OD值。以OD值接近1．0時，且P／N值在2．0以上并呈現最大者為最佳作用時間。

1．10咖啡堿偶聯蛋白包被板批內穩定性、批間穩定性測定取4個不同濃度、每個濃度同樣的2份樣本，分別在同一酶標板上檢測4次，測批內變異，在不同酶標板上測4次，測批間變異，根據批內和批間變異系數判定批內穩定性、批間穩定性。

2結果與分析

2．1咖啡堿－BSA偶聯蛋白的合成與表征

2．1．1咖啡堿與BSA偶聯效果的檢測通過檢測，僅觀察到咖啡堿－BSA偶聯蛋白單一吸收峰（11．867min），其出峰時間基本與BSA（12．047min）一致，未觀察到咖啡堿吸收峰（26．823min），表明經G－25凝膠分離純化后的偶聯物中不含有游離的咖啡堿。

2．1．2偶聯蛋白的紫外光譜分析由圖1可知，BSA在278nm處有一明顯吸收峰，咖啡堿在270nm有明顯的吸收峰，而偶聯抗原的紫外吸收圖譜同時出現2個特征吸收峰（278nm和271．5nm），分別對應于BSA、咖啡堿的吸收峰，且有一定的位移，表明咖啡堿與載體蛋白BSA發生了偶聯反應。

2．1．3偶聯蛋白中咖啡堿／BSA偶聯比制備的偶聯蛋白咖啡堿－BSA中咖啡堿／BSA的偶聯比（摩爾比）為8．56，說明偶聯蛋白具有較好的免疫性，達到了常規免疫抗原的要求。

2．2EGCG－OVA偶聯蛋白的合成與表征

2．2．1EGCG–OVA偶聯蛋白的檢測通過檢測，僅觀察到EGCG–OVA偶聯蛋白單一吸收峰（12．647min），其出峰時間基本與OVA（12．813min）一致，未觀察到EGCG吸收峰（29．842min），表明經G－25凝膠分離純化后的偶聯物中不含有游離的EGCG。

2．2．2偶聯蛋白的紫外光譜分析由圖2可知，OVA在280nm處有一明顯吸收峰，EGCG在270nm有明顯的吸收峰，而偶聯蛋白的紫外吸收圖譜同時出現2個特征吸收峰（280nm和269nm），分別對應于OVA、EGCG的吸收峰，且有一定的位移。表明，EGCG與載體蛋白OVA發生了偶聯反應。

2．2．3偶聯蛋白中EGCG／OVA偶聯比試驗結果表明，所制備的偶聯物EGCG－OVA中EGCG／OVA的偶聯比（摩爾比）為6．35，說明偶聯蛋白具有較好的免疫性，達到了常規免疫抗原的要求。

2．3咖啡堿－BSA偶聯蛋白的最佳包被濃度測定咖啡堿—BSA偶聯蛋白6個不同包被濃度的OD值，結果表明，包被濃度為2μg／mL時，OD值接近1．000，且P／N值最大，為3．12。所以咖啡堿－BSA偶聯蛋白的最佳包被濃度為2μg／mL。

2．4咖啡堿－BSA偶聯蛋白最佳包被時間和溫度咖啡堿－BSA偶聯蛋白以2μg／mL濃度包被板子，測定4個不同包被時間和溫度下的OD值，結果表明：4℃過夜條件下，OD值接近1．000，且P／N值最大，為2．87。所以咖啡堿－BSA偶聯蛋白最佳包被條件為4℃過夜。

2．5EGCG－OVA偶聯蛋白最佳工作濃度當EGCG－OVA偶聯蛋白的工作濃度為1∶1000時，OD值接近1．000，且P／N值最大，為2．67，所以EGCG－OVA偶聯蛋白最佳工作濃度為1∶1000。

2．6咖啡堿與EGCG反應最佳作用時間的確定由表1可知，在作用時間為60min時，咖啡堿與EGCG的OD值均接近1．000，P／N值均為最大，因此，咖啡堿與EGCG反應最佳作用時間為60min。

3結論與討論

3．1結論試驗采用雙交聯法制備偶聯蛋白，通過紫外光譜對偶聯蛋白進行分析，計算偶聯比，所制備的偶聯物咖啡堿－BSA中咖啡堿／BSA的偶聯比（摩爾比）為8．56，偶聯物EGCG－OVA中EGCG／OVA的偶聯比（摩爾比）為6．35。說明，偶聯蛋白具有較好的免疫性，達到了常規免疫抗原的要求。EGCG與咖啡堿相互作用的條件：咖啡堿－BSA偶聯蛋白的最佳包被濃度為2μg／mL；最佳包被條件為4℃過夜；EGCG－OVA偶聯蛋白最佳工作濃度為1∶1000；咖啡堿與EGCG反應最佳作用時間為60min。

3．2討論3．2．1載體蛋白的篩選載體蛋白主要用于偶聯劑與EGCG或咖啡堿相連接，偶聯后成為ELISA反應的基本單位，分別與咖啡堿、EGCG相偶聯的載體蛋白必須不同。載體蛋白的篩選主要考慮以下3個方面：1）不同小分子與不同載體蛋白的非特異性結合小；2）蛋白自身及不同蛋白的相互作用小；3）包被固相載體效果好。牛血清白蛋白（BSA）及卵清蛋白（OVA）是ELISA反應中常用的2種蛋白，蛋白自身及彼此之間相互作用小，因此試驗選取牛血清白蛋白（BSA）及卵清蛋白（OVA）作為與咖啡堿及EGCG偶聯的適宜載體蛋白。

3．2．2偶聯劑的選擇篩選出載體蛋白后，偶聯劑的選擇及反應條件的確定就是EGCG與咖啡堿相互作用的ELISA檢測方法建立的關鍵之一。偶聯劑可防止大分子載體蛋白對咖啡堿、EGCG的屏蔽效應，即防止咖啡堿、EGCG與載體結合時，被包埋在卷曲凹陷的大分子結構中，影響兩者的相互作用。在和載體蛋白的偶聯過程中還應充分考慮到咖啡堿、EGCG與載體蛋白的比例，偶聯時pH值、溫度、光照、滲透壓、加樣速度等條件對偶聯效果也有影響。因1，4－丁二醇二縮水甘油醚（雙環氧試劑）偶聯條件溫和，偶聯效果好。因此試驗選取1，4－丁二醇二縮水甘油醚（雙環氧試劑）作為偶聯劑。

3．2．3ELISA檢測反應條件的研究ELISA檢測法的影響反應因素較多，特別是固相載體的包被難達到各個體之間的一致，咖啡堿偶聯蛋白包被濃度、包被時間和溫度是關鍵因素。茶多酚EGCG偶聯蛋白的濃度也是影響反應的主要因素之一。在ELISA檢測中，咖啡堿與茶多酚EGCG反應的完成需要有一定的溫度和時間，控制不同的反應溫度和時間，可以使反應達到最佳效果。因此，試驗選取咖啡堿偶聯蛋白包被濃度、包被時間和溫度、EGCG偶聯蛋白濃度、咖啡堿與EGCG反應時間等參數進行ELISA檢測反應條件的研究，以確定反應的最佳條件。試驗利用ELISA法特異性強、靈敏度高的特點，將ELLSA法用于測定茶多酚與咖啡堿之間的相互作用，大幅提高茶多酚與咖啡堿之間相互作用檢測的特異性與靈敏度，解決了分光光度法和C—NMR法存在的特異性差、靈敏度低、定量困難、資金投入高、操作要求嚴等不足，為茶飲料渾濁沉淀產生機理的分析提供特異性更強、靈敏度更高的方法。

作者：楊玲張高賀登芳陶于菊單位：貴州省生物研究所貴州都勻優加加生物科技有限公司