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《海洋學報》2015年第十一期

1引言

陸源與海源有機碳在近岸海域與河口呈混合狀態，識別其來源對研究生物地球化學過程具有重要意義。沉積物中有機碳同位素分析（δ13C）是示蹤有機質來源的重要手段之一，已得到廣泛應用。其原理是基于陸源與海源自生有機碳的終端不同，分別來源于CO2（δ13C＝－7‰）和HCO－3（δ13C＝1‰）［1］。沉積物中δ13C范圍多為－6‰～－35‰；典型的陸源C3植物多為－23‰～－30‰，C4植物多為－13‰（－9‰～－17‰）；典型的海洋浮游植物約為－22‰（－17‰～－24‰）。海洋沉積物中的碳存在有機和無機兩種形式，無機碳主要以碳酸鹽的形式存在，含13C豐富的無機碳酸鹽，會導致δ13C值顯著偏正，影響對有機碳來源的判斷。因此，海洋沉積物δ13C分析前，必需進行酸化處理以去除無機碳的影響。

在樣品酸化過程中，一方面要保證無機碳酸鹽完全去除，另一方面要避免有機物被氧化，揮發或分餾，以及酸溶性有機物的流失。目前，常用的方法包括酸洗法、酸蒸法和原位酸洗法。酸洗法是指用非氧化性酸性溶液（常用的有HCl、H2SO3和H3PO4）去除樣品中的無機碳酸鹽，然后用Mill－Q水洗至中性，減少對儀器的影響，但在洗至中性的過程中可能導致部分酸溶性有機碳流失。酸蒸法是將適量樣品放于銀杯中，用Mill－Q水浸潤后，置于鹽酸蒸汽中去除無機碳酸鹽，并避免酸溶性有機碳的流失，但較強的酸性環境會破壞樣品中較易分解的有機組份。原位酸洗法是對銀杯中適量的樣品，逐步增加非氧化性酸的滴加體積，直至無機碳酸鹽完全去除，該方法可以避免酸溶性有機碳的流失以及高濃度的酸性環境對有機質的破壞。但是，原位酸洗法和酸蒸法對無機碳去除效率較低，尤其是對白云石和菱鐵礦，并且生成的氯化物會對儀器產生影響。除上述常用方法外，部分實驗室用非原位酸洗法（如法國LittoralEnvironmentetSociétés（LIENSs）－UMR7266實驗室）。非原位酸洗法是稱取適量樣品于玻璃小瓶中，采取從低濃度開始，加入完全去除樣品中無機碳酸鹽的酸，該方法對無機碳去除效率較高，但因未對多余的酸進行處理，樣品中的殘留酸可能會影響δ13C的分析。鑒于不同酸化方法存在的優勢和劣勢，需要針對不同沉積物選擇不同的酸化方法。

國外學者利用不同的酸以及不同酸化方式，對不同類型的沉積物進行了處理，發現酸化結果與沉積物中無機碳含量的高低以及無機碳酸鹽的類型（方解石、文石和菱鐵礦等）顯著相關。研究表明，我國近海海域沉積物中無機碳酸鹽礦物主要為方解石和文石，但不同海區兩種組分所占比例有所不同，且總無機碳含量存在差異，大亞灣（南海）較低，而長江口（東海）相對較高（表1），然而，國內學者對不同海洋沉積物酸化方法缺乏優化研究。因此，本研究分別選取了無機碳含量差異顯著的溫帶與熱帶河口、海灣海洋沉積物樣品，比較了3種不同酸化方法（酸洗法、酸蒸法和非原位酸洗法）對有機碳同位素分析的影響，期望為我國海洋沉積物δ13C分析提供更為合理、可靠的前處理方法。

2實驗方法

2．1樣品選取及相關信息本研究選取了4個來源于澳大利亞熱帶河口、海灣的高無機碳含量樣品，以及6個來源于我國溫帶河口、海灣的低無機碳含量樣品，將樣品冷凍干燥，用瑪瑙研缽研磨混勻后用大進樣量元素分析儀（德國El－mentar公司，型號：VarioMACROcube）對碳含量進行分析。稱取約150mg原樣測定總碳，稱取約150mg酸化后的樣品（酸洗法，詳細步驟見2．2）測定有機碳。無機碳的含量為總碳與有機碳之差。詳細信息見表2。

2．2樣品酸化方法1：酸洗法稱取約1g樣品于15mL聚丙烯離心管中，每個樣品3個平行樣，分別加入10mL2mol／LHCl、6％H2SO3和1mol／LH3PO4，充分搖勻后，超聲2min，然后靜置24h，其間應搖勻樣品2～3次，使其充分反應。24h后離心倒出上清液，再加入10mLMill－Q水，搖勻離心，重復以上水洗步驟直至用pH試紙檢測溶液為中性。將樣品冷凍干燥后，在瑪瑙研缽中研磨使其均質化。精確稱取適量樣品于錫舟中壓實包樣，上機測試。方法2：酸蒸法該實驗主要參考Harris等［9］和Komada等［18］的研究結果，將最短和最長酸蒸時間分別設定為6h和48h。稱取適量樣品于銀杯中，放入96孔板，每個樣品3個平行樣。先在每個銀杯中滴加50μLMill－Q水，浸潤樣品，以使樣品能夠充分接收酸蒸汽。大約50mL濃鹽酸（37％HCl）倒入準備好的玻璃燒杯中，放在干燥器的底部，將96孔板放在干燥器內，置于通風櫥中。分別在6h、9h、12h、15h、18h、24h、30h和48h將樣品依次取出60℃烘干，用錫舟將銀杯一起壓實包樣，上機測試。方法3：非原位酸洗稱取樣品約80～100mg于玻璃小瓶中，先加入1mL0．5mol／LHCl，輕輕晃動，使無機碳酸鹽與HCl充分反應，根據沉積物中無機碳的含量確定添加HCl的濃度（如：1mol／L、2mol／L），直到瓶內無氣泡產生，使加入的鹽酸將沉積物中的無機碳完全去除，然后將樣品超聲，超聲好的樣品60℃烘干。烘干后的樣品加入1mLMill－Q水，同時沖洗玻璃瓶內壁，晃動均勻并超聲，然后冷凍干燥。干燥后在瑪瑙研缽中研磨使其均質化。精確稱取適量樣品于錫舟中壓實包樣，上機測試。

2．3樣品同位素分析本研究中的樣品δ13C分析由氣體穩定同位素質譜（美國ThermoFisher公司，型號：MAT253）測定，儀器的精度小于0．2‰。樣品δ13C（‰）是相對于國際標準物質PDB（PeeDeeBelemnite）。

2．4數據分析本研究的數據分析方法主要是單因素方差分析（ANOVA），在α＝0．05的顯著性水平下，如果p＞0．05，表明不存在顯著差異。所涉及數據用SPSS16．0分析處理，圖表在SigmaPlot12．5中完成。

3結果與討論

3．1酸洗法中酸種類的影響酸洗法因對儀器影響小，在國內應用最為廣泛。因此，本研究選取了3種不同酸2mol／LHCl、6％H2SO3和1mol／LH3PO4進行處理。結果表明：對于無機碳含量較高的澳大利亞樣品，用2mol／LHCl、6％H2SO3和1mol／LH3PO4處理后δ13C的范圍分別為－19．28‰～－21．46‰、－3．06‰～－16．63‰和－3．62‰～－18．53‰（圖1）。比較發現，6％H2SO3和1mol／LH3PO4酸洗后的結果偏正于海洋沉積物δ13C的范圍，而2mol／LHCl酸洗的結果更符合海洋沉積物δ13C特征?？赡苁怯捎?％H2SO3和1mol／LH3PO4對菱鐵礦和白云石的去除效率較低［19］，比如白云石需要在70℃高溫下才能溶解［8］，故難以去除樣品中的無機碳酸鹽，而HCl對不同類型的無機碳酸鹽去除效率都很高［20］。對于無機碳含量較低的我國溫帶河口、海灣樣品，除了6％H2SO3酸洗的樣品YRE2（－19．28‰）和YRE3（－16．16‰）的δ13C結果異常外，ANOVA分析表明其余樣品3種酸洗后δ13C的結果差異并不顯著（p＞0．05），范圍為－21‰～－24‰，與其他學者在鄰近區域的研究結果一致。酸洗法的研究結果表明，6％H2SO3和1mol／LH3PO4去除無機碳酸鹽的效率較低，對于無機碳含量較高的樣品并不適合；而2mol／LHCl去除無機碳效率高且穩定性最好，適用于不同無機碳含量的海洋沉積物，這與Ken－nedy等［8］研究結果一致。

3．2酸蒸法中酸蒸時間的影響圖2給出了不同酸蒸時間下（6～48h），樣品δ13C的測定結果。結果表明：除樣品KGR2外，其余樣品均隨酸蒸時間的增加，δ13C值表現出3個階段：逐漸偏負、相對穩定、突然偏負（圖2）。對于無機碳含量較高的澳大利亞樣品，6～15h酸蒸后，δ13C值逐漸偏負約1‰，表明樣品中的無機碳酸鹽正逐漸被去除；15～24h酸蒸后，δ13C值變化幅度小于0．5‰，表明樣品中的無機碳酸鹽已經完全去除，其δ13C值范圍為－23．7‰～－26．8‰；24h酸蒸后，δ13C值突然偏負約2‰～3‰，且樣品平行性較差。這可能是由于較強的酸性環境破壞樣品中較易分解的有機組分，以酸蒸汽的形式揮發［11，13］；或者是由于酸蒸時間過長導致C被污染［15］。對于無機碳含量相對較低的我國溫帶河口、海灣樣品，其δ13C變化的3個階段表現為：6～9h逐漸偏負約1‰；9～15h相對穩定（樣品SSLB12～15h相對穩定），δ13C值變化幅度小于0．3‰，范圍為－21．3‰～－24．9‰；15h后，尤其是18h后，突然偏負約2‰～3‰，且不穩定。酸蒸法的研究結果表明，酸蒸時間超過24h，會導致δ13C分析結果顯著偏負，這與Komada等研究結果一致。對于無機碳含量較高的澳大利亞樣品，15h酸蒸較為合理，而對于無機碳含量相對較低的我國溫帶河口、海灣樣品，9h酸蒸較為適宜。

3．3非原位酸洗法結果由于KGR1、KGR2、YRE1和YRE3樣品量不足，本研究只對其余6個樣品進行了方法3（非原位酸洗）處理。該方法采取直接滴加鹽酸的方法去除無機碳酸鹽，同時在酸化過程中可以觀察玻璃小瓶內的反應情況，以判斷無機碳是否完全去除。在操作過程中，采取從低濃度開始，加入剛好去除樣品中無機碳酸鹽的酸體積，減少樣品中的殘留酸。表3為樣品測定結果，與海洋沉積物δ13C的范圍相吻合。3．43種酸化方法的比較根據3．1、3．2和3．3的優化結果，將方法1中2mol／LHCl酸洗的結果，方法2中15h（澳大利亞熱帶河口、海灣海洋沉積物樣品）和9h（我國溫帶河口、海灣海洋沉積物樣品）酸蒸后的結果與方法3的結果進行了對比（圖3）。對于無機碳含量較高的澳大利亞樣品（CB1和CB2），方法1和方法3的結果差異較小，其δ13C值范圍為－21‰～－22‰，而方法2的結果顯著偏負約4‰（約－26‰），表明酸蒸法并不適應于無機碳含量較高的澳大利亞熱帶河口、海灣沉積物樣品。對于無機碳含量較低的我國溫帶河口、海灣樣品，3種酸化方法的結果差異較小，其δ13C值均在－22‰～－23‰的范圍內，其中方法3的結果相對偏正于方法1和方法2（圖3），表明3種酸化方法都適用于無機碳含量相對較低的我國溫帶河口、海灣沉積物樣品。方法1中，HCl在去除無機碳酸鹽的過程中會生成吸濕性鹽（如CaCl2•H2O），特別是對于碳酸鈣含量較高的沉積物。這會導致樣品吸收空氣中的水分，對包樣的精確性造成影響；其次，這類氯化物腐蝕性很強，會影響儀器檢測的準確性。水洗可以避免吸濕性鹽對δ13C分析的影響，但含13C豐富的化合物（如：蛋白質、氨基酸以及多糖類物質）易水解流失，導致方法1中δ13C結果相對于方法3偏負（圖3）。方法2（酸蒸法）和方法3（非原位酸洗）避免了酸洗過程中可溶性有機物的流失，但是，方法2中有機質暴露在強酸環境中，對較易分解的13C豐富的有機組分破壞較大，導致δ13C結果相對于方法3偏負（圖3），這與Komada等研究結果一致。方法3避免了方法2中高濃度酸環境對有機組分的破壞，故δ13C結果較方法1和方法2偏正（圖3）。然而，方法3與方法2面臨同樣一個問題，即部分未揮發的酸和生成的吸濕性鹽會殘留在樣品中，可能會影響δ13C的分析。為證實該影響的程度，本研究從黃渤海挑選了16個沉積物樣品，用方法3進行酸化處理，處理后的樣品于2015年1月第一次上機測試，然后放置于干燥器中2個月后（2015年3月）第二次上機測試，發現兩者之間差異較?。▓D4），表明殘留酸對δ13C的分析影響輕微。通過以上分析可知，方法3不但可以保證無機碳酸鹽完全去除，而且對樣品中的有機組分以及儀器的影響最小。此外，方法3操作安全，避免了離心水洗過程中（方法1），底部沉積物隨上清液倒出的可能性；也避免了酸化過程中（方法2），因反應劇烈導致樣品飛濺、以及產生的吸濕性鹽包裹未反應無機碳的可能性。因此，方法三是去除海洋沉積物中不同無機碳酸鹽含量較為理想的方式。

4結論

通過研究酸化過程對海洋沉積物中有機碳同位素分析的影響，我們得到如下結論：（1）酸洗法中6％H2SO3和1mol／LH3PO4并不能完全去除較高無機碳含量樣品中的無機碳酸鹽；2mol／LHCl對去除海洋沉積物中不同無機碳含量更為理想。（2）酸蒸法并不適用于無機碳含量較高的沉積物樣品；無機碳含量較低的沉積物樣品，9h酸蒸較為適宜。（3）非原位酸洗達到了較為理想的效果，不僅避免了水洗過程中酸溶性有機物的流失，而且降低了殘留酸對樣品有機組份以及儀器設備的影響。

作者：彭亞君 王玉玨 劉東艷 唐丹玲 單位：中國科學院 煙臺海岸帶研究所 海岸帶環境過程與生態修復重點實驗室 中國科學院大學 中國科學院 南海海洋研究所 熱帶海洋環境動力學重點實驗室