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《菌物學(xué)報(bào)》2016年第四期

摘要：

銹菌種群龐大，可以引起許多重要經(jīng)濟(jì)作物和林木病害，嚴(yán)重威脅全球糧食和林業(yè)生產(chǎn)安全。全基因組分析為銹菌基因功能研究、毒性變異研究及銹菌演化規(guī)律研究提供了重要基礎(chǔ)，為制定銹病有效防控策略和創(chuàng)制抗銹新材料提供理論依據(jù)。本文綜述了目前銹菌全基因組分析領(lǐng)域的進(jìn)展，對銹菌的基因組結(jié)構(gòu)、基因組成、基因組變異等特征進(jìn)行了歸納分析，對基因組變異與其專性寄生特性的關(guān)系、基因組變異對其毒性變異的可能影響等進(jìn)行了闡述?；蚪M學(xué)將為最終揭示銹菌生活史復(fù)雜性和毒性高度變異性的根本成因提供有力工具。

關(guān)鍵詞：

銹菌，基因組，毒性，變異，基因組測序，進(jìn)化

銹菌屬于擔(dān)子菌門真菌，已發(fā)現(xiàn)130多屬，5000余種，是高等專性活體寄生真菌。寄主植物被銹菌侵染后，在葉片、葉鞘、莖或果實(shí)上長出大量的橙色、褐色或者紅色銹狀孢子堆，有的還可在枝干上引起腫瘤、粗皮、叢枝、曲枝等癥狀，或造成落葉、焦梢、生長不良等。嚴(yán)重時(shí)孢子堆密集成片，植株因體內(nèi)水分大量蒸發(fā)而迅速枯死。銹病是世界范圍廣泛分布的農(nóng)作物和森林作物重大災(zāi)害性病害（Petersen1974；Aniksteretal.2004）。近一個(gè)世紀(jì)以來，銹病中最具代表性的小麥銹病頻繁爆發(fā)流行，造成包括我國在內(nèi)的全球小麥主產(chǎn)國毀滅性損失。研究表明，銹菌的毒性變異是導(dǎo)致小麥品種抗病性的“喪失”，進(jìn)而造成病害大規(guī)模流行的根本原因。因此，揭示銹菌毒性變異的基礎(chǔ)成因是解決品種抗性“喪失”，實(shí)現(xiàn)病害持久控制的必由之路。生物遺傳變異的重要表現(xiàn)是其各種途徑導(dǎo)致的基因組變異，包括基因組序列變異和結(jié)構(gòu)變異。序列變異主要有單核苷多態(tài)性、短序列插入與缺失）、微衛(wèi)星或簡單重復(fù)序列）和轉(zhuǎn)座子等類型；結(jié)構(gòu)變異主要包括大片段插入與缺失、基因有/無變異和基因拷貝數(shù)變異，表現(xiàn)為基因組區(qū)域大范圍的插入、缺失、復(fù)制、倒置（inversion）和移位（translocation）。研究表明，植物病原菌基因組水平的各類變異可以最終導(dǎo)致病原菌毒性變異。因此，全基因組測序分析和比較基因組分析是揭示銹菌類真菌演化規(guī)律和毒性變異分子機(jī)制的有效途徑。近年來，基因組學(xué)的迅猛發(fā)展為最終揭示銹菌生活史復(fù)雜性和毒性高度變異性的根本成因提供了有力工具。本文綜述了目前銹菌全基因組測序分析領(lǐng)域的進(jìn)展，對銹菌的基因組結(jié)構(gòu)、基因組成、基因組變異等特征進(jìn)行了歸納分析，對基因組變異與其專性寄生特性的關(guān)系、基因組變異對其毒性變異的可能影響等進(jìn)行了闡述。

1銹菌的全基因組測序分析

銹菌為專性寄生、難以在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)、生活史具復(fù)雜多型現(xiàn)象和遺傳轉(zhuǎn)化困難等使得銹菌的基因組學(xué)及基因功能研究發(fā)現(xiàn)相對滯后。在第一個(gè)植物病原真菌——水稻大角間座殼（稻瘟菌）Magnaportheoryzae基因組草圖（Deanetal.2005）公布6年后，基于Sanger法測序的兩個(gè)銹菌—[禾柄銹菌小麥?；秃吐淙~松‐楊柵銹菌]全基因組測序分析發(fā)表。隨后，基于二代高通量測序技術(shù)的5個(gè)銹菌基因組草圖先后發(fā)表（表1）。在銹菌基因組測序中，用于DNA提取的菌體都是相對易于收獲的夏孢子——一種雙核的厚壁孢子?；蚪MDNA序列存在高度的雜合性，雜合度是人類基因組的1.6倍（Zhengetal.2013），給銹菌基因組拼接帶來嚴(yán)重障礙，作為基因組拼接完整性重要參數(shù)的CotigN50和ScalffoldN50均大大低于水稻大角間座殼等其他真菌基因組草圖。這在基于二代測序技術(shù)的銹菌基因組拼接中更為明顯，條形柄銹菌小麥專化型Pucciniastriiformisf.sp.tritici‐130基因組采用全基因組鳥槍法測序拼接，ScalffoldN50甚至只達(dá)到5.2kb（表1）。條形柄銹菌小麥?；蚉ucciniastriiformisf.sp.tritici‐CY32基因組通過采用Fosmid‐to‐Fosmid二次拼接策略將這一參數(shù)提高到125kb（Zhengetal.2013）。在已公布的銹菌基因組中普遍包含相對較大數(shù)量的預(yù)測蛋白編碼基因，基因數(shù)量在14445個(gè)～25288個(gè)之間（表2）。對兩個(gè)小麥銹菌（Pst和Pgt）和落葉松‐楊柵銹菌（Mlp）編碼蛋白基因的對比分析表明，兩種小麥銹菌的同源基因有5560個(gè)，而Pst和Mlp的同源基因只有1937個(gè)，相比于Mlp、Pst和Pgt的同源關(guān)系更近。Pst、Pgt和Mlp種特異基因數(shù)分別為4469、5827和4922個(gè)。在Pst特異性的4469個(gè)基因中，只有14.43%（1066）和3.38%（250）在GO和PAMGO數(shù)據(jù)庫中有已知功能的同源基因（Zhengetal.2013）。這表明在基因組水平上，銹菌物種之間的差異十分顯著，這或許與其生活史的復(fù)雜性及轉(zhuǎn)主侵染的適應(yīng)性需求相關(guān)。

2銹菌基因組大小與銹菌演化

基因組承載著生物進(jìn)化的印跡，基因組大小是物種的重要特征。基因組的大小和動(dòng)態(tài)變化對物種的進(jìn)化適合度、繁殖和產(chǎn)生多樣性的非有性機(jī)制都有直接的影響（D’hondtetal.2011）。真核生物基因組的大小變化范圍很大，真菌是真核生物中基因組相對較小的類群。利用流式細(xì)胞技術(shù)對1850種真菌基因組大小進(jìn)行評估，發(fā)現(xiàn)所檢測真菌平均基因組大小僅為44.2Mbp，擔(dān)子菌門真菌平均基因組大小為70.4Mbp，而銹菌平均基因組大小為305.5Mbp。最近發(fā)表的鬼針草單孢銹菌基因組達(dá)到了2489Mbp，是目前已知最大的真菌基因組（Ramosetal.2015a）。銹菌和其他真菌相比明顯表現(xiàn)出基因組增大的進(jìn)化趨向，這種擴(kuò)增趨勢可能與其寄生?；院头敝硰?fù)雜性（無性、有性及稀少有性）的進(jìn)化需求有關(guān)。具有大的、可塑性強(qiáng)的基因組可能有利于銹菌在分支選擇（cladeselection）中避免滅絕，在與寄主共進(jìn)化中以更高的頻率產(chǎn)生新的毒性類型偶然地?cái)U(kuò)展到新的寄主群體或新寄主。不同銹菌基因組大小差異可以達(dá)到30倍，從櫟柱銹菌梭形?；虲ronartiumquercuumf.sp.fusiforme基因組大小76.6Mbp到鬼針草單孢銹菌U.bidentis基因組大小為2489Mbp。銹菌屬內(nèi)種間的基因組大小變動(dòng)范圍也明顯大于其他真菌，說明基因組大小的變異可能在銹菌進(jìn)化、遺傳分化和寄主?；匝莼邪l(fā)揮活躍的作用（Ramosetal.2015b）。從已發(fā)表的植物病原真菌基因組對比結(jié)果可以看出專性活體營養(yǎng)型真菌如銹菌、白粉菌等基因組明顯大于非專性活體營養(yǎng)、半活體營養(yǎng)和死體營養(yǎng)型真菌（圖1）。盡管目前尚不能完整解釋這一現(xiàn)象的成因，但通過增大基因組（轉(zhuǎn)座子作用為主要?jiǎng)恿Γ┛梢栽黾舆z傳多樣性，從而減少銹菌作為活體營養(yǎng)的專性寄生菌在群體遺傳漂移（drift）中滅絕的可能性。

3銹菌基因組的轉(zhuǎn)座子和重復(fù)序列組分

銹菌類真菌基因組大小的顯著膨脹主要是其轉(zhuǎn)座子和重復(fù)序列成分的增加造成的，其基因數(shù)量并沒有同比例顯著增加。轉(zhuǎn)座子成分的活性可能是銹菌群體遺傳和寄生專化性（毒性）保持多樣性的重要?jiǎng)恿Γ@對未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)主寄主的不完全銹菌（無性繁殖為主）可能更為重要，它們也往往保持著較大的基因組（Ramosetal.2015b）。落葉松‐楊柵銹菌和禾柄銹菌小麥?；腿蚪M序列分析結(jié)果表明，其基因組中不存在大片段的重復(fù)，但是含有大量的轉(zhuǎn)座子和重復(fù)序列，約占整個(gè)基因組的45%。比較不同營養(yǎng)型真菌基因組轉(zhuǎn)座子和重復(fù)序列含量發(fā)現(xiàn)，與非專性活體營養(yǎng)真菌相比，專性活體營養(yǎng)銹菌類基因組轉(zhuǎn)座子和重復(fù)序列含量明顯更高（圖2）。在不同銹菌基因組中，不同類型的轉(zhuǎn)座子含量存在明顯差異（圖3）。在落葉松‐楊柵銹菌基因組中，Ⅱ類末端反向重復(fù)序列（TIR，14%）轉(zhuǎn)座子的比例較Ⅰ類長末端重復(fù)序列反轉(zhuǎn)錄（LTR，8%）轉(zhuǎn)座子的比例更高。與之相反，在禾柄銹菌小麥專化型基因組中Ⅱ類（TIR）轉(zhuǎn)座子和Ⅰ類（LTR）轉(zhuǎn)座子所占基因組的比例則分別為9.8%和12.4%。在條形柄銹菌小麥?；突蚪M中Ⅰ類長末端重復(fù)序列反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（LTR）和Ⅱ類末端反向重復(fù)序列（TIR）轉(zhuǎn)座子含量最高，分別占基因組的27%和17%（Zhengetal.2013）。咖啡駝孢銹菌Hemileiavastatrix的Ⅰ類長末端重復(fù)序列反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（LTR）最多，占總基因組大小的38.7%。同時(shí)在咖啡駝孢銹菌基因組中發(fā)現(xiàn)了四種新的Ⅰ類長末端重復(fù)序列反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（LTR）。由于基因組中大量轉(zhuǎn)座子的存在造成基因組的重組，使得近源種間直系同源家族基因的共線性發(fā)生了很大的變化。目前轉(zhuǎn)座子含量的差異對不同銹菌基因組以及致病性的影響還有待研究。轉(zhuǎn)座子是基因組的基本組成部分，是促使基因組防御系統(tǒng)發(fā)展的主要推動(dòng)力，并且可以多種方式對基因組的可塑性和演變作貢獻(xiàn)。

4銹菌基因家族擴(kuò)增與丟失

基因注釋及比較基因組分析發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)化過程中銹菌基因家族出現(xiàn)大量的擴(kuò)增或缺失，以及家族內(nèi)基因數(shù)量的增加或減少。相比于擁有4583個(gè)基因家族的原始祖先，禾柄銹菌小麥?；停≒gt）目前有5413個(gè)基因家族，有1241個(gè)基因家族的增加和411個(gè)基因家族的減少。而落葉松‐楊柵銹菌（Mlp）分別增加了909個(gè)基因家族，減少了188個(gè)基因家族，目前擁有5304個(gè)基因家族（表2）。一些膨脹的基因家族有物種特異性，可能在進(jìn)化過程中這些基因?qū)闹鲗；云鹬匾饔谩Ｔ诤瘫P菌小麥?；停≒gt）和落葉松‐楊柵銹菌（Mlp）中，共有5045個(gè)同源基因。但是，由于擴(kuò)張的轉(zhuǎn)座子對基因組大量的改組，使得同源基因的共線性很低。Duplessiseta（l2011）利用silico對Mlp和Pgt基因組分泌蛋白（SP）進(jìn)行基因預(yù)測和手動(dòng)注釋，分別鑒定出了1184和1106個(gè)SP，其中譜系特異性基因分別占74%和84%。Mlp和Pgt基因組SP基因家族的膨脹非常顯著，占整個(gè)擴(kuò)張基因組家族的10%（表2）。對接種葉片后表達(dá)量最高的前100個(gè)基因分析發(fā)現(xiàn)：落葉松‐楊柵銹菌（Mlp）和禾柄銹菌小麥?；停≒gt）中分泌蛋白的數(shù)量分別占到50%和28%。在侵染的植物組織中大多數(shù)上調(diào)表達(dá)的SP基因是譜系特異性的，只有16%在兩種銹菌中有同源基因。Zhengetal.（2013）通過比較3種銹菌（Pst、Pgt、Mlp）基因組成分發(fā)現(xiàn)，條形柄銹菌小麥?；吞禺惖幕蛑卸鄶?shù)已知功能的基因類型屬于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，激酶、碳水化合物激活酶類和分泌蛋白（SPs），其中分泌蛋白所占比例最高。表明這些分泌蛋白基因進(jìn)化速率很高，保守性很低，可能在毒性變異中發(fā)揮著重要作用（圖4）。

Nemrieta（l2014）通過對4種銹菌（Pst、Pgt、Mlp、Mli）基因組候選分泌蛋白家族預(yù)測發(fā)現(xiàn)，編碼幾丁質(zhì)酶的家族總共有61個(gè)成員，其中32個(gè)是分泌蛋白。這表明一些效應(yīng)蛋白可能從一些非分泌原始祖先進(jìn)化而來，從而在真菌細(xì)胞壁以外的寄主細(xì)胞壁或者在寄主細(xì)胞內(nèi)部執(zhí)行相似的生物學(xué)功能。對已知的亞麻柵銹菌無毒基因、蠶豆銹菌效應(yīng)蛋白、以及玉米黑粉菌（Ustilagomaydis）效應(yīng)蛋白分支酸變位酶1進(jìn)行生物信息學(xué)分析，在（Pst、Pgt、Mlp）中也未發(fā)現(xiàn)同源基因，或者同源基因不具有無毒基因特性（Persoonsetal.2014）。這表明分泌蛋白基因家族具有較高的進(jìn)化速率以及較低的保守性。子囊菌綱的黃枝孢菌效應(yīng)蛋白可以分泌到胞外被寄主免疫受體所識別（DeWitetal.2009）。然而，銹菌候選的胞外分泌蛋白是否也參與寄主免疫響應(yīng)有待進(jìn)一步研究。Petreetal（2016）通過將Mlp候選的效應(yīng)蛋白注射本氏煙的方法研究其亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示六個(gè)效應(yīng)蛋白定位于細(xì)胞核、核仁、葉綠體、線粒體和細(xì)胞外。其中一個(gè)效應(yīng)蛋白葉綠體靶蛋白1可以模擬寄主轉(zhuǎn)運(yùn)肽進(jìn)入葉綠體和線粒體，表明這些效應(yīng)蛋白可能操縱線粒體和葉綠體來完成其專性寄生。

5銹菌的基因丟失與生活方式演化

銹菌是活體營養(yǎng)的專性寄生菌，不能人工培養(yǎng)。推測銹菌在進(jìn)化的過程中可能丟失了部分腐生性營養(yǎng)擔(dān)子菌類所特有的某些基因。比較分析21種已測序不同營養(yǎng)型真菌基因組中碳水化合物激活酶類基因成分發(fā)現(xiàn)，Mlp和Pgt具有相對較少的糖苷水解酶編碼基因，數(shù)量和擔(dān)子菌綱的雙色蠟?zāi)⑤^為相似，但是相比半活體營養(yǎng)型、死體營養(yǎng)型和腐生型生物則要少很多。在進(jìn)化為活體專性營養(yǎng)型的過程中，銹菌類真菌已經(jīng)失去了一些編碼分泌糖苷水解酶和多聚糖裂解酶的基因。但是，編碼一些清除植物纖維素和半纖維素的糖苷水解酶的基因家族，例如GH7、GH10、GH12、GH26和GH27均出現(xiàn)了輕微的擴(kuò)增。這些酶可能在銹菌侵染寄主的初始階段起主要作用，例如蛋白酶、酯酶和一些碳水化合物激活酶類基因在被侵染的植物體內(nèi)表達(dá)量高度上調(diào)，表明這些侵入菌絲可以通過水解酶類穿透進(jìn)入寄主細(xì)胞（ElGueddarietal.2002）。銹菌通過侵入的菌絲在寄主體內(nèi)形成吸器來獲取糖類和氨基酸等養(yǎng)分對于成功建立起活體專性營養(yǎng)型互作具有重要意義。Mlp、Pgt和Mli缺失了一些參與硝酸鹽同化吸收的基因，例如硝酸鹽和亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及亞硝酸鹽還原酶。Mlp具有基本的硫素同化吸收相關(guān)基因，而Pgt、Pst則沒有。Pgt缺少了亞硫酸鹽還原酶（SiR）的α和β亞基，而Mlp的SiR的β亞基缺失，導(dǎo)致失去轉(zhuǎn)酮醇酶活性，但是在亞麻柵銹菌（Mli）中存在完整的硫素代謝途徑。銹菌缺失部分氮素和硫素同化吸收相關(guān)途徑與他們專性活體寄生方式一致，它們可以通過擴(kuò)張的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族直接從寄主植物細(xì)胞獲取氮素（NH4+或氨基酸）和硫素（Spanu，2012）（圖4）。銹菌可能通過丟失一些非必需基因來平衡其大進(jìn)化（macroevolution）壓力。

6銹菌基因組變異與毒性演化

在銹菌中，還未發(fā)現(xiàn)像水稻大角間座殼那樣由于大片段缺失造成分泌蛋白缺失而引起的毒性變異。甚至在比較毒性差異最大的不同生理小種分泌蛋白組時(shí)，也沒有在任何一個(gè)小種中發(fā)現(xiàn)超過15個(gè)預(yù)測的分泌蛋白基因缺失。這表明基因的缺失可能不是造成銹菌毒性改變的主要原因，而不同生理小種的分泌蛋白等位基因的變異可能是造成毒性變異的重要原因。通過重測序4個(gè)不同毒性的條形柄銹菌小麥專化型生理小種，生物信息學(xué)分析鑒定不同小種候選效應(yīng)蛋白基因的單核苷酸多態(tài)性（SNP）變異，在2999個(gè)分泌蛋白中發(fā)現(xiàn)5個(gè)候選多態(tài)性分泌蛋白基因。這些多態(tài)性分泌蛋白可能反應(yīng)不同生理小種條形柄銹菌小麥?；蛯μ囟ɑ蛐图闹餍←湹目焖龠m應(yīng)性。Zhengetal（2013）以Pst‐CY32參照基因組，對5個(gè)世界范圍的重要流行菌系（CY23、PK‐CDRD、Hu09‐2、104E137A‐、Pst‐78）進(jìn)行重測序分析，檢測到超過100000個(gè)SNPs。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)不同菌系還存在豐富SV、InDel等遺傳變異。其中，分布于編碼區(qū)的cSNPs占總共SNP數(shù)量的35%，這些SNPs可能影響銹菌小種毒性和寄生特性的演化。以此全基因組SNP數(shù)據(jù)構(gòu)建的6個(gè)菌系的進(jìn)化關(guān)系顯示，Pst分離系之間有明顯的遺傳分化，有性生殖可能在其毒性演化過程中發(fā)揮了重要作用。通過對15個(gè)落葉松‐楊柵銹菌不同毒性分離系進(jìn)行了重測序，結(jié)果顯示與Mlp‐98AG31基因組相比，不同菌系存在大量的單核苷酸變異（SNVs）、多核苷酸變異（MNVs；連續(xù)的SNVs）和短序列的插入/缺失變異（InDels）。同時(shí)，落葉松‐楊柵銹菌16%的基因上游1000bp區(qū)段有超過10個(gè)SNPs，表明這些區(qū)段可能與基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)。

重復(fù)序列誘導(dǎo)的點(diǎn)突變是真菌所特有的一種真核生物基因沉默機(jī)制，1987年在粗糙脈孢菌Neurosporacrassa中首次發(fā)現(xiàn)。Hornseta（l2012）通過對來自擔(dān)子菌門3個(gè)不同亞門（傘菌亞門、黑粉菌亞門、柄銹菌亞門）的8種擔(dān)子菌轉(zhuǎn)座子的變異分析發(fā)現(xiàn)在柄銹菌亞門的落葉松‐楊柵銹菌（Mlp）和禾柄銹菌小麥專化型（Pgt）中存在大量的RIP情況。在Mlp和Pgt中RIP主要發(fā)生在Gypsy類轉(zhuǎn)座子的TpCpG三核苷酸區(qū)域，使TpCpG轉(zhuǎn)換成為TpTpG，從而形成富含T+A的片段。而在傘菌亞門和黑粉菌亞門中均未發(fā)現(xiàn)此類現(xiàn)象。重復(fù)序列誘導(dǎo)點(diǎn)突變（RIP）在減數(shù)分裂過程中通過突變多拷貝DNA，能最大限度地減少轉(zhuǎn)座子的影響，這一特性被認(rèn)為是為轉(zhuǎn)座子傳播提供的一種防御機(jī)制。此外，發(fā)生RIP的序列多集中在著絲粒區(qū)域，主要是轉(zhuǎn)座子甲基化后的痕跡。

7結(jié)語

銹菌類真菌基因組巨大、雜合度高，菌系地理分布廣泛、生態(tài)位多樣，蘊(yùn)含著眾多基因組進(jìn)化待解之謎。目前，高通量測序的低成本化和第三代測序技術(shù)的成熟化為銹菌結(jié)構(gòu)基因組學(xué)提供了前所未有的機(jī)遇，通過基因組精細(xì)測序、群體重測序以及比較基因組學(xué)分析可以更深入地揭示銹菌寄生?；赃M(jìn)化和毒性變異的遺傳基礎(chǔ)。對基因組變異的深入研究將為最終在分子水平揭示其毒性變異機(jī)制提供理論依據(jù)，為預(yù)測新的生理小種的產(chǎn)生及銹病防治提供有力工具。

作者：焦志鑫 申一林 李晶晶 許君 劉娜 康振生 鄭文明 單位：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院  小麥玉米作物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心 西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院  旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室