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《基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)雜志》2015年第四期

1煙堿代謝途徑

1.1吡啶環(huán)的形成對于吡啶環(huán)用于合成煙堿的直接底物目前尚無定論。體內(nèi)放射性同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)證實(shí)，煙酸先還原為3,6二氫煙酸(Leete,1980)，至于后者如何脫羧、如何與吡啶環(huán)縮合、是否有中間物質(zhì)的參與等問題仍不得而知。吡啶核苷酸途徑起始于L-天冬氨酸，其在天冬氨酸氧化酶(partateoxide,AO)作用下氧化形成琢-亞氨基琥珀酸(Katohetal.,2006)。緊接著，3-磷酸甘油醛與琢-亞氨基琥珀酸在喹啉酸合成酶(quinolinatesynthe,QS)催化下凝結(jié)形成喹啉酸(Ka-tohetal.,2006)。在許多細(xì)菌，包括大腸桿菌中已發(fā)現(xiàn)了AO和QS的存在，但煙草中還未見報(bào)道。給煙草喂食[3-14C]p后，在吡啶環(huán)的C-2和C-3位置能檢測到放射性(JackaniczandByerrum,1966)。煙堿吡啶環(huán)是煙草和相關(guān)物種NAD生物合成的中間產(chǎn)物(WallerandHenderson,1961)。擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果顯示，At5g14760編碼的蛋白與E.coli的AO有42%的同源性，At5g50210編碼的蛋白與E.coli的QS有24%的同源性。為了驗(yàn)證At5g14760和At5g50210是否分別編碼AO和QS，Katoh等(2006)利用缺失表達(dá)AO和QS的nadB-和nadA-E.coli菌株進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。當(dāng)nadB-中有At5g14760表達(dá)時(shí)，E.coli能形成煙酸，當(dāng)nadA-中有At5g50210表達(dá)時(shí)，E.coli也能形成煙酸。這一結(jié)果表明，At5g14760和At5g50210分別編碼了AO和QS。生物信息學(xué)預(yù)測擬南芥AO和QS定位于質(zhì)體中，Katoh等(2006)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其地位于葉綠體中。胚胎發(fā)育時(shí)期，AO或QS的無義突變均是致死的，這表明AO和QS對細(xì)胞代謝至關(guān)重要(Katohetal.,2006)。喹啉酸在喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(quinolinicacidphosphoribosyltransfere,QPT)的催化作用下形成煙酸單核苷酸(NAMN)，以此進(jìn)入吡啶核苷酸循環(huán)，進(jìn)而形成煙酸。與PMT在甲基吡咯烷途徑的關(guān)鍵作用類似，前期的許多研究表明，QPT是煙堿生物合成的分支途徑吡啶核苷酸循環(huán)的限速步驟(Wagneretal.,1986)。Conkling等(1990)利用差異雜交技術(shù)首先從煙草中分離出了根特異性的QPT，當(dāng)時(shí)命名為TobRD2，之后重新命名為NtQPT1。Sinclair等(2000)通過篩選N.tabacum根的cDNA文庫真正的分離鑒定出了NtQPT1。在這兩項(xiàng)研究中，QPT的功能都是基于其序列與其它物種QPT序列的相似性推斷出來的，然后在QPT缺失的E.coli突變株中進(jìn)行功能互補(bǔ)試驗(yàn)來證實(shí)。QPT活性研究表明，NtQPT1的表達(dá)在aabb中顯著降低，打頂和機(jī)械刺激使之上調(diào)表達(dá)，受植物生長素抑制(Sinclairetal.,2000)。以往的研究表明，QPT的活性調(diào)節(jié)與PMT十分相似，但PMT僅參與生物堿合成，而QPT則對于出生代謝也很重要，作為進(jìn)入吡啶核苷酸循環(huán)的起點(diǎn)，形成重要的輔因子NAD。Shoji和Hhimoto(2011)發(fā)現(xiàn)，煙草基因組中存在兩個(gè)密切相關(guān)的QPT。QPT1在所有組織中本底表達(dá)，在頂端分生組織中表達(dá)略強(qiáng)，可能與NAD的產(chǎn)生有關(guān)，QPT1對于調(diào)節(jié)煙堿合成的遺傳、生物、非生物因子無應(yīng)答。QPT2即NtQPT1，其僅在根組織中強(qiáng)烈表達(dá)，并與其它參與煙堿生物合成的結(jié)構(gòu)基因協(xié)同調(diào)控。由于QPT參與初生代謝，所以QPT下調(diào)并不能作為降低煙草中煙堿含量的首先方案。

1.2吡啶環(huán)和吡咯環(huán)的結(jié)合PIP家族異類黃酮還原酶類蛋白A622和小檗堿橋連酶類蛋白NtBBL是煙堿成環(huán)所必需的(De-Boeretal.,2009;Kajikawaetal.,2009)。然而，兩個(gè)環(huán)如何連接形成煙堿仍未弄清楚。A622為一個(gè)異類黃酮還原酶基因，是利用消減雜交技術(shù)隨PMT一起得到分離的(Hibietal.,1994)。研究證實(shí)A622與PMT和其它煙堿代謝基因具有十分相似的表達(dá)模式(Caneetal.,2005)，但一直缺乏說明A622參與煙堿生物合成的證據(jù)。2009年的兩個(gè)報(bào)道補(bǔ)充了這一點(diǎn)。N.glauca(葉片中以假木賊堿為主要生物堿,并有少量的煙堿和新煙堿)的A622-RNAi株系，三種生物堿含量急劇下降(DeBoeretal.,2009)。Kajikawa等(2009)利用RNAi技術(shù)在煙草BY-2細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物的根毛區(qū)均抑制了A622的表達(dá)。MeJA處理的BY-2細(xì)胞，A622抑制后新煙堿水平降至對照的10%以下，同時(shí)其它生物堿含量也有相似的下降(Kajikawaetal.,2009)。有趣的是，無論是轉(zhuǎn)基因植物還是BY-2細(xì)胞中，A622-RNAi引起的生物堿含量下降，都伴隨著煙酸茁-N-葡萄糖苷(NaNG)的積累，而NaNG被認(rèn)為是煙酸的脫毒產(chǎn)物。野生型煙草的根毛區(qū)以高濃度煙酸處理，也引起了生長抑制和NaNG積累，表型上也與上述RNAi植株經(jīng)茁-雌二醇誘導(dǎo)后十分相似(Kajikawaetal.,2009)。盡管已證實(shí)A622參與吡啶生物堿的合成，但該基因編碼的酶活性尚不清楚。A622酶與PBE還原酶有極高的序列一致性，但A622重組蛋白無催化此反應(yīng)的能力(Shojietal.,2002)。A622能特異性結(jié)合NADPH，能催化NADPH依賴的氧化還原反應(yīng)。A622-RNAi的毛狀根中NaNG和N-甲基吡咯啉陽離子都有積累，這證實(shí)了A622的功能，A622參與所有生物堿合成所需的煙酸衍生物前體的形成，同時(shí)參與吡啶環(huán)和吡咯環(huán)的縮合反應(yīng)(Kajikawaetal.,2009)。煙堿生物合成研究的最新突破在于BBL的發(fā)現(xiàn)和鑒定，BBL蛋白參與煙堿形成的最后階段。與煙堿代謝途徑的其它基因一樣，BBL也是一個(gè)小基因家族，至少有4個(gè)亞型，在aabb植株中其表達(dá)下降(Kajikawaetal.,2011)。BBL-RNAi植株葉片煙堿含量降至對照的10%。經(jīng)MeJA誘導(dǎo)的BY-2細(xì)胞BBL-RNAi，所有的吡啶生物堿含量幾乎檢測不到。與A622相似，BBL的酶活性尚未得到確認(rèn)，但這些蛋白定位在液泡，可能具有FAD-依賴型氧化還原酶功能，影響煙草所有的吡啶生物堿的合成。對BBL抑制型轉(zhuǎn)基因植株中特殊代謝物的檢測表明，BBL在煙堿合成的后期，很可能是最后階段起作用。不論是在轉(zhuǎn)基因毛狀根中誘導(dǎo)型抑制BBL，還是在轉(zhuǎn)基因植物中組成型下調(diào)BBL表達(dá)，均引起一種特殊代謝物二氫異位煙堿(DMN)的積累(Kajikawaetal.,2011)。DMN是一條直鏈N-甲胺基，其C-3位置上有一個(gè)吡啶環(huán)。DMN的積累僅在根部，說明那些負(fù)責(zé)生物堿轉(zhuǎn)運(yùn)至葉片的分子轉(zhuǎn)運(yùn)體并不識別DMN。據(jù)此推測，BBL的作用階段在吡啶環(huán)和N-甲基-吡咯環(huán)起始縮合之后。利用重組BBL的酵母實(shí)驗(yàn)研究是否BBL的真正作用是DMN-煙堿的氧化，得到了否定的結(jié)果，但是酵母的翻譯和轉(zhuǎn)錄后加工畢竟不同于煙草(Kajikawaetal.,2011)。盡管BBL催化的酶促反應(yīng)本質(zhì)還有一些問題沒有解決，但是它們的發(fā)現(xiàn)有助于我們對生物堿合成的最后階段的理解。

2煙堿轉(zhuǎn)化

煙堿可在煙堿去甲基化酶作用下形成降煙堿。通常降煙堿僅占吡啶生物堿總量的2%~4%，但遺傳上的不穩(wěn)定性導(dǎo)致在種群中自發(fā)產(chǎn)生高降煙堿含量的轉(zhuǎn)化植株，成為煙草產(chǎn)業(yè)的一大難題。長久以來，已進(jìn)行了大量嘗試，通過雜交和培育以盡量減少轉(zhuǎn)化植株的出現(xiàn)。最初強(qiáng)調(diào)維持低降煙堿水平主要為了避免不好的氣味和香氣特征的出現(xiàn)。然而，后來發(fā)現(xiàn)降煙堿是NNN(N-硝基-降煙堿)的直接前體，NNN是煙草制品中一種主要的強(qiáng)致癌物。降煙堿是通過煙堿N-甲基化作用形成的，煙堿去甲基化酶催化降煙堿產(chǎn)生的一個(gè)重要特征是，這一反應(yīng)優(yōu)先發(fā)生于葉片中，而不是根中，并且在成熟葉片和烘烤過程中活性較高(Wada,1956)。隨后的酶學(xué)研究顯示，煙堿去基化是一個(gè)氧化過程而非轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)，催化這一反應(yīng)的酶表現(xiàn)出細(xì)胞色素P450家族的單氧化酶的典型特征(Chelvarajanetal.,1993;HaoandYeoman,1998)。Siminszky等(2005)利用基因芯片技術(shù)對轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化的burley株系的研究表明，CYP82E4與轉(zhuǎn)化植株中高降煙堿含量有關(guān)。CYP82E4的功能驗(yàn)證是通過在酵母微粒體中重組酶的體外分析和轉(zhuǎn)基因植物中基因的抑制與過表達(dá)分析完成的(Siminszkyetal.,2005)。在CYP82E4的鑒定過程中發(fā)現(xiàn)，煙草基因組編碼了多個(gè)與CYP82E4相似的基因，它們在核酸和氨基酸水平均有90%以上的序列一致性。CYP82E2/3/4同時(shí)被分離鑒定出來，但是在異源酵母系統(tǒng)和轉(zhuǎn)基因植物中均無煙堿去甲基化酶(NND)活性(Siminszkyetal.,2005)。據(jù)此推測，煙草基因組至少有另一個(gè)NND基因，負(fù)責(zé)低水平的降煙堿的合成。進(jìn)一步研究證實(shí)，存在兩個(gè)與CYP82E4相似的基因CYP82E5v2和CYP82E10，編碼有活性的NND(GavilanoandSim-inszky,2007;Lewisetal.,2010)，三個(gè)NND活性相似，但其表達(dá)譜差別很大。CYP82E4受衰老和乙烯的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，尤其在轉(zhuǎn)化植株中(Chakrabartietal.,2008)。相反CYP82E5v2或CYP82E10不受衰老誘導(dǎo)，且在轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化植株中表達(dá)無變化。CYP82E5v2在綠色、未衰老葉片中表達(dá)，但比轉(zhuǎn)化植株衰老葉片中CYP82E4的表達(dá)水平低很多(GavilanoandSiminszky,2007)。CYP82E10在轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化植株中表達(dá)水平均較低，但主要是在根中表達(dá)(Lewisetal.,2010)。煙草煙堿去甲基化酶基因家族的研究得出，CYP82E5v2和CYP82E10主要負(fù)責(zé)典型的非轉(zhuǎn)化植株中低水平降煙堿合成，而CYP82E4負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)化植株中降煙堿含量顯著升高的部分，其直接證據(jù)為，Lewis等(2010)通過化學(xué)誘導(dǎo)同時(shí)敲除突變?nèi)齻€(gè)NND，降煙堿水平幾乎接近最佳的CYP82E4-RNAi植株。煙堿和降煙堿均有S-和R-型，差別在于吡咯環(huán)的2''''-C。煙堿庫的穩(wěn)定主要以S-為主，R-僅占約0.2%。降煙堿庫的立體異構(gòu)體組成變化很大，R-可占到4%~75%(Liuetal.,2008)。對重組生物CYP82E4、CYP82E5v2和CYP82E10的底物特異性研究表明，NND對映異構(gòu)體的選擇性造成了降煙堿異構(gòu)體組成的可變性(CaiandBush,2012)。CYP82E5v2和CYP82E10對R-有極高的底物選擇性，而R-和S-都可作為CYP82E4的底物。因此，當(dāng)CYP82E4表達(dá)水平很低時(shí)，降煙堿庫中R-降煙堿比例較高；而CYP82E4高表達(dá)時(shí)，則以S-降煙堿為主。理解降煙堿的立體異構(gòu)體組成很重要，因?yàn)镾-NNN(推測來自S-降煙堿)的致癌性遠(yuǎn)高于R-NNN(Laoetal.,2007)。

3煙堿代謝的上游調(diào)控

煙堿生物合成是由激素、轉(zhuǎn)錄因子(TF)、蛋白激酶和其它蛋白參與的復(fù)雜調(diào)控過程。除了參與生物堿合成的重要結(jié)構(gòu)基因，轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜研究也有效地鑒定出了兩個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄因子家族，它們能有效地調(diào)節(jié)細(xì)胞中生物堿的合成。ossens等(2003)利用MeJA(茉莉酸甲酯)處理和無處理的BY-2細(xì)胞對比研究，鑒定出459個(gè)差異表達(dá)基因，其中包括一組ERF(乙烯響應(yīng)因子)轉(zhuǎn)錄因子。為了區(qū)分真正參與生物堿合成調(diào)控的基因，他們在2005年開發(fā)出了一套高處理量的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，鑒定能激活PMT啟動子-熒光素酶報(bào)告基因的基因。利用這一系統(tǒng)從17個(gè)候選基因中篩選出NtORC1和NtJAP1這2個(gè)基因。NtORC1和NtJAP1都屬于ERF超家族，是煙草基因組中最大的TF(轉(zhuǎn)錄因子)家族(Rushtonetal.,2008)。雖然NtJAP1過表達(dá)并未引起煙草吡啶生物堿的顯著升高，但是ORC1過表達(dá)則使煙堿含量升高接近2倍(DeBoeretal.,2011b)。能夠證實(shí)ERF家族轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)了生物堿合成的最令人信服的證據(jù)在于，低煙堿株系Burley21(aabb)的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，與野生型相比，ERF189顯著下調(diào)(Shojietal.,2010)。而除了ERF189外，至少還有6個(gè)具有很高序列相似性、同屬于IX的ERF，在B位點(diǎn)的純合突變株中均缺失。這些TF都特異性地與GCC-box元件結(jié)合，而該元件存在于數(shù)個(gè)參與煙堿代謝途徑的結(jié)構(gòu)基因的啟動子區(qū)域(Shojietal.,2010;ShojiandHhimoto,2013)。另一類誘導(dǎo)煙堿合成的TF屬于MYC2樣的bHLH家族。Todd等(2010)用MeJA處理N.benthami-ana根組織，利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默系統(tǒng)篩選差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)緊密相關(guān)的bHLH基因，NbbHLH1和NbbHLH2，作為N.benthamina中JA(茉莉酸)誘導(dǎo)的生物堿合成的正調(diào)節(jié)因子。Shoji和Hhimoto(2011)在N.Tabacum中得到了相似的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了NtMYC1和NtMYC2。凝膠遷移分析結(jié)果顯示，特異性結(jié)合G-box元件的轉(zhuǎn)錄因子，存在于煙堿代謝途徑結(jié)構(gòu)基因的啟動子區(qū)域。MYC2樣bHLH類TF可能直接調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，或通過激活ERF類TF間接調(diào)節(jié)生物堿合成。轉(zhuǎn)錄因子的鑒定主要是基于擬南芥(Arabidopsisthaliana)進(jìn)行的JA信號途徑的研究。通過篩選對冠菌素不敏感的擬南芥突變體，鑒定出COI1作為JA信號通路的重要調(diào)節(jié)因子。COI1是一個(gè)F-box蛋白，作為CYP82E3泛素連接酶復(fù)合體的特異性決定因子，引導(dǎo)蛋白質(zhì)進(jìn)入26S蛋白酶體進(jìn)行降解。COI1的靶蛋白之一是JAZ(一種轉(zhuǎn)錄抑制子,JmonateZIM-domain)蛋白，在擬南芥中JAZ通過結(jié)合MYC2抑制JA響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。存在COI1和JA-Ile(茉莉酮酸-異亮氨酸)時(shí)，JAZ阻遏蛋白降解，MYC2激活具有G-box的JA響應(yīng)基因(Memelink,2009)。對煙草中COI1和JAZ同源物的轉(zhuǎn)基因研究發(fā)現(xiàn)，煙草中生物堿合成具有類似的調(diào)節(jié)方式(Shojietal.,2008)。此外，利用酵母雙雜交系統(tǒng)研究煙草JAZ蛋白，表明NtMYC2/NbbHLH1蛋白之間存在互作，但NtJAZ與ERF189和ERF221之間則無互作(DeBoeretal.,2011a)。蛋白磷酸化事件也參與調(diào)解MeJA激活的煙堿合成基因。MeJA處理的BY-2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄譜篩選獲得的蛋白激酶激酶(MAPKK)參與了調(diào)節(jié)過程(ossensetal.,2003)。MeJA存在時(shí)JAM1和NbbHLH1共表達(dá)，報(bào)告基因活性升高130倍。相反地，在瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中加入MAPKK抑制劑，能顯著減弱MeJA介導(dǎo)的ORC1的激活(DeBoeretal.,2011)。MAPKK蛋白磷酸化級聯(lián)反應(yīng)作為翻譯后調(diào)節(jié)機(jī)制，通過MeJA途徑活化煙堿合成基因，并且很可能作用于有ERF和bHLH轉(zhuǎn)錄因子參與的復(fù)合體。綜上所述，在不存在JA或功能類似物(如JA-Ile)時(shí)，JAZ蛋白與MYC2/bHLH轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，它們能夠阻止生物堿合成基因或B位點(diǎn)ERF的轉(zhuǎn)錄。存在JA時(shí)，通過26S蛋白酶體復(fù)合物促進(jìn)了COI1對JAZ蛋白的識別和降解。當(dāng)JAZ阻遏物被降解后，G-box識別的MYC2/bHLH轉(zhuǎn)錄因子可自由活化生物堿合成基因。MYC2/bHLH活化B位點(diǎn)基因?qū)е翬RF轉(zhuǎn)錄因子與煙堿生物合成基因啟動子的GCC-box區(qū)域結(jié)合，額外刺激轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)。最后，JAM激活JAM1的轉(zhuǎn)錄或活化啟動子，蛋白磷酸化級聯(lián)反應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng)MYC2/hHLH-ERF轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體。

4煙堿的轉(zhuǎn)運(yùn)

近期研究致力于闡明生物堿的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和定位。2009年，兩個(gè)負(fù)責(zé)生物堿轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白被發(fā)現(xiàn)，它們把生物堿轉(zhuǎn)運(yùn)至中央液泡中。NtMATE1和NtMATE2編碼的蛋白具有96.4%的一致性，它們是通過野生型和aabb的根組織進(jìn)行差異轉(zhuǎn)錄組分析得到鑒定的(Shojietal.,2009)。Nt-JAT1是通過對MeJA處理的BY-2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析得到的(ossensetal.,2003)，Morita等(2009)證實(shí)了其作為生物堿轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能，屬于MATE家族。NtMATE1/2和Nt-JAT1之間的相似度包括：定位于液泡膜、廣泛的底物特異性(包括煙草內(nèi)源性吡啶生物堿)、H+依賴的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能、酵母中超表達(dá)會導(dǎo)致其錯(cuò)誤定位至質(zhì)膜，從而引起煙堿的外流。盡管它們有較多相似性，但是NtMATE1/2和Nt-JAT1蛋白只有大約35%的氨基酸序列一致性。而且，Nt-JAT1在葉片、莖和根中均有表達(dá)，而NtMATE1/2主要在根中表達(dá)(Shojietal.,2009)。總之，煙草中MATE型轉(zhuǎn)運(yùn)體保護(hù)細(xì)胞免受生物堿或其它陽離子的毒性損傷，將煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡中貯存。近期，另一個(gè)煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)體NUP1(nicotineuptakepermee1)被鑒定出來，與MATE型轉(zhuǎn)運(yùn)體有很多不同的特性。NUP1為質(zhì)膜定位蛋白，將煙堿由質(zhì)外體空間轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)(Hildrethetal.,2011)。與MATE不同，NUP1對煙堿具有很高的特異性，不能轉(zhuǎn)運(yùn)萜類生物堿甚至新煙堿和降煙堿。雖然NUP1-RNAi轉(zhuǎn)基因植株葉片和根中煙堿積累下降，但是植物根系向葉片轉(zhuǎn)運(yùn)煙堿的能力并未下降。當(dāng)培養(yǎng)基中補(bǔ)充煙堿時(shí)，NUP1-RNAi植株根系中積累較少的煙堿，并且對于根伸長的抑制效應(yīng)敏感度也較低(Hildrethetal.,2011)。Hildreth等(2011)提出，NUP1功能在于通過調(diào)節(jié)根細(xì)胞與根際環(huán)境之間煙堿的釋放和重吸收，以維持煙堿水平的穩(wěn)態(tài)。近年來關(guān)于煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)體的研究有較大進(jìn)展，但對于吡啶生物堿如何轉(zhuǎn)載進(jìn)入根系木質(zhì)部以啟動根-莖轉(zhuǎn)運(yùn)，目前尚未見報(bào)道。有趣的是，N.alata能夠在根系合成生物堿，但不具有轉(zhuǎn)運(yùn)至葉片的能力。N.alata和N.langsdorffii(近緣品種,但能長距離轉(zhuǎn)運(yùn)生物堿)的種間嫁接和雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)，N.alata的非轉(zhuǎn)運(yùn)表型相對于N.langsdorffii的可轉(zhuǎn)運(yùn)表型為顯性(Pakdeechanuanetal.,2012)。在本實(shí)驗(yàn)室的研究中發(fā)現(xiàn)，NUP的表達(dá)情況與煙堿的含量相關(guān)性較高。

5展望

煙草不僅是重要的經(jīng)濟(jì)作物，而且是植物研究的模式植物。因此，煙草產(chǎn)業(yè)和學(xué)術(shù)研究者對煙草基因組的結(jié)構(gòu)和功能的理解都具有長久的興趣。雖然煙草煙堿的合成、遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)運(yùn)以及代謝途徑已基本清晰，且多數(shù)代謝步驟、轉(zhuǎn)運(yùn)過程和調(diào)控途徑都有部分基因得到了分離和鑒定，但普通煙草為多倍體植物，每個(gè)基因都有大約5個(gè)同源基因，目前尚未完全分離出來，因此，煙堿代謝功能基因的解析仍需要進(jìn)行大量的研究。近年來，煙堿合成的遺傳調(diào)控機(jī)制研究已經(jīng)成為煙堿合成途徑調(diào)控研究的熱點(diǎn)問題，因此，煙堿代謝的遺傳調(diào)控因子的分離和鑒定將是近期的主要研究內(nèi)容。隨著新一代測序技術(shù)和組裝技術(shù)的發(fā)展，煙草全基因組的解碼也獲得了長足的進(jìn)步，2012至2014年，了7個(gè)完整的煙草基因組序列(WangandBennetzen,2015)。因此，利用高通量測序技術(shù)獲得煙草全基因組或轉(zhuǎn)錄組序列，將會是今后研究的重要方向。實(shí)際上煙堿生物合成調(diào)控是復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，生物內(nèi)在因素和外界環(huán)境均可影響花青素的合成，從分子的角度看，基因表達(dá)的多種信號傳遞網(wǎng)絡(luò)均可指煙堿合成的結(jié)構(gòu)基因，其中的信號因子和信號傳遞的途徑還有待于深入研究。隨著分子生物學(xué)研究技術(shù)和手段的飛速發(fā)展，將逐步加速煙堿代謝調(diào)控機(jī)制的解析，為低降煙堿含量煙草分子育種提供新的保障。

作者：金云峰李軍營張建波龔明單位：云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院