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《基因組學與應用生物學雜志》2015年第四期

1結果與分析

1.1VACVase-like理化性質的分析利用Protparam在線軟件分析植物VACVase-like基因的蛋白序列(表1)，植物14個氨基酸殘基數目除了甜瓜MELO3C009679P1的398個氨基酸外，均在440以上，擬南芥的分子量最大，為56.2111kD，甜瓜MELO3C009679P1分子量最小，為44.7561kD，分析其穩定性發現除了可可樹穩定以外，其余均為不穩定的蛋白，黃瓜的VACVase-like蛋白最不穩定為51.30%，穩定指數>40%不穩定。對所有的VAC-Vase-like蛋白的總疏水性進行分析，發現除了葡萄、可可樹、草莓正值外。其余均為負值，然而他們的值都在-0.2~+0.12之間均為兩性氨基酸，研究報道認為數值介于-0.5~+0.5主要為兩性氨基酸(付海輝等,2010)，說明這三種植物的VACVase-like蛋白是疏水性蛋白。

1.2植物VACVase-like氨基酸序列系統發生樹的構建與分析為了研究基因之間的進化關系，植物14個VAC-Vase-like基因的系統進化樹的構建采用距離依靠法(distancemethods)中的鄰位相接法(neighbor-Joining,NJ)方法，對VACVase-like蛋白進行序列的比對分析，通過自舉法分析(bootstrapanalysis)，當Bootstrap的經驗值越大，越接近于初始設定的重復抽樣次數，即可信度就越高(馬勇等,2014)。分析結果表明，自舉法分析的期望值在每個節點上都較高，這很可能是VAC-Vase-like家族成員之間的氨基酸序列在進化過程中高度保守所導致的，而進化樹的可靠性通過獨立元素法(discretecharactermethods)中的另外一種構建法，即最大簡約法(maximumparsimonymethods,MP)構建的進化樹進行驗證。并通過MEGA5.10軟件構建系統發生樹(圖1)，通過綜合分析可進一步獲知，在物種進化的過程中，在功能分化上的VACVase-like基因家族是高度保守的，在進化分析過程中，擬南芥(AT1G64670)、甜瓜(MELO3C009679P1)與其他植物的進化上的親緣關系較遠，進化初期便發生了分歧，但是各分支內仍然有物種內獨特的旁系同源基因。桃和草莓、大豆和鷹嘴豆、番茄的兩個蛋白以及黃瓜和甜瓜的蛋白在進化過程中高度保守，在進化上的親緣關系最近。

1.3VACVase-like親/疏水性的分析通過蛋白質的親水性和疏水性值的分析，可預測蛋白質表面的氨基酸殘基的分布。利用ProtScale在線工具對植物14個VACVase-like氨基酸序列的親水性和疏水性進行預測，結果如圖2所示。蓖麻和擬南芥蛋白的異亮氨酸有最高值為4.5，表明其疏水性最強，精氨酸的最低分值為-4.5，表明其親水性最高，親疏水性氨基酸分布均勻。經整體分析，蓖麻和擬南芥蛋白存在明顯的疏水區和親水區，用同樣的方法分別對黃瓜、葡萄、可可樹、毛果楊、桃、草莓、大豆、鷹嘴豆、番茄和甜瓜等植物的親疏水性進行分析，結果表明這幾種植物均存在明顯的疏水區和親水區(其它幾種植物的圖片分析結果未顯示)。

1.4VACVase-like信號肽及導肽的預測和分析信號肽是新合成多肽鏈中用于指導蛋白質的跨膜轉移的N-末端的氨基酸序列，由15~30個氨基酸組成。一個為帶有正電的堿性氨基末端及帶有負電荷的C較長末端，其含小分子氨基酸，是信號序列切割位點，而信號肽的主要功能區一段能夠形成d螺旋結構疏水序列。在信號肽的引導下，新合成的蛋白質進入內質網腔，而信號肽序列則在信號肽酶的作用下被切除(王漢屏,2008)。利用SignalP4.1Server在線軟件，使用神經網絡(NN)和隱馬爾可夫模型(HMM)兩種分析蓖麻和擬南芥氨基酸序列的信號肽所在位置，結果見圖2。擬南芥和蓖麻的max.C、Y值都是YES，并且預測存在信號肽的可能性分別為0.671、0.468和0.510，并且存在明顯的酶切位點，預測可能屬于分泌蛋白，其它植物的VACVase-like氨基酸序列采用同樣的方法對進行分析，結果顯示均含有信號肽結構，推測可能屬于分泌蛋白。導肽是新生蛋白N-端一段大約20~80個氨基酸的肽鏈，又稱轉運肽(transitpeptide)或導向序列(targetingsequence)，它是游離核糖體上合成的蛋白質的N-端信號。主要是帶正電荷的堿性氨基酸(特別是Arg和Lys)含量較為豐富，具有較強的穿透組織和細胞膜的能力，將肽鏈準確的定位在某一個組織上或者細胞的細胞器上是其主要功能(金元昌等,2008)。因此，通過導肽的預測，對蛋白質的功能分析、作用機制和亞細胞定位具有一定的意義。利用targetP1.1server(Nielsenetal.,1997;Emanuelssonetal.,2000;2007)在線軟件對蓖麻和擬南芥氨基酸序列進行預測，結果如圖3所示。結果表明，蓖麻VACVase-like存在導肽結構，定位于分泌途徑其預測值為0.520，且可信度為5級，擬南芥VACVase-like存在導肽結構，定位于分泌途徑其預測值為0.901，且可信度為3級(可信度區分1:diff>0.800;2:0.800>diff>0.600;3:0.600>diff>0.400;4:0.400>diff>0.200;5:0.200>diff)，CmVACVL02為分泌途徑信號肽的可能最大。

1.5VACVase-like跨膜結構域的預測和分析跨膜結構域(transmembranedomain,TM)是由20個左右的疏水氨基酸殘基形成琢螺旋，與膜的脂雙分子層的疏水區域相互作用，將跨膜蛋白錨定在細胞膜中形成跨膜通道(翟中和等,2007)。通過TM-pred和TMHMMServerv.2.0在線軟件同時預測擬南芥和蓖麻VACVase-like和人VACVase氨基酸序列的跨膜結構域，再利用TMHMMServerv.2.0在線軟件進行證明結果的準確性。結果顯示(圖4)，擬南芥(NP_194145)含有四個跨膜螺旋，第一個跨膜螺旋從16~40位氨基酸，由膜外到膜內；第二個跨膜螺旋從219~242位氨基酸，由膜內到膜外；第三個跨膜螺旋從291~308位氨基酸，相由膜外到膜內；第四個跨膜螺旋從347~365位氨基酸，由膜內到膜外。蓖麻VACVase蛋白同樣含有四個跨膜螺旋，第一個跨膜螺旋從22~40位氨基酸，由膜外到膜內；第二個跨膜螺旋從199~221位氨基酸，由膜內到膜外；第三個跨膜螺旋從326~344位氨基酸，由膜外到膜內；第四個跨膜螺旋從347~365位氨基酸，由膜內到膜外。對其它植物VACVase-like蛋白序列進行分析，結果如表2所示。通過證明跨膜結構域存在也證實了信號肽存在的可能性。1.6亞細胞定位預測和分析亞細胞定位是指某種蛋白或表達產物在細胞內的具體存在和發揮功能的部位。利用WoLFPSORT(Hortonetal.,2007)在線分析軟件對植物VAC-Vase-like蛋白的亞細胞定位進行預測和分析，結果表明，擬南芥(AT1G64670)的質膜得分8.0，擬南芥(NP_194145)在各組織中的分值較低，蓖麻的胞質和葉綠體的分值分別為5.0和4.0。番茄(XP_00424-4657)的在質膜得分10.0，桃的在細胞核的得分9.0，草莓的在胞質的得分9.0，其它在各組織中的分布預測結果如圖5所示。分析結果表明，VACVase-like蛋白在不同植物中存在和發揮功能部位均不相同。

1.7蛋白質二級結構的預測和分析蛋白質的多肽鏈的主鏈骨架依靠羰基和酰胺基團之間形成的氫鍵作用，盤曲折疊，形成有規律的空間排布，形成比較穩定的二級結構，進一步加工形成有活性的特定構象。常見的二級結構有琢-螺旋和茁-折疊，另外還有茁轉角、延伸鏈和無規則卷曲。VACVase-like蛋白的二級結構本文利用CFSSP(chou&fasmansecondarystructurepredinctionserver)(ChouandFasman,1974a;1974b)在線軟件進行預測，通過預測結果的分析，琢-螺旋、茁-折疊、無規則卷曲和茁轉角是蓖麻和擬南芥VACVase-like蛋白的組成元件，而琢-螺旋和茁-折疊是最主要的構成元件。對其它植物的VACVase-like蛋白的二級結構采用同樣的方法進行預測，通過預測結果可以看出，該蛋白家族在二級結構的構成元件上比例大致相似，說明VACVase-like基因編碼的蛋白質家族的二級結構和功能上具有一定的相似性。

1.8植物VACVase-like蛋白的三級結構的預測和分析蛋白質三級結構是指蛋白質分子處于它的天然折疊狀態的三維構象，是在蛋白質二級結構的基礎上進一步盤繞，折疊形成緊密的立體空間結構。隨著蛋白質結構數據庫中數據量的增多，利用信息學的方法對蛋白質的高級結構進行預測和分析，對理解的結構及功能具有一定意義，一般采用從頭算法(abinitio)、線串法(threading)和同源建模(homologymodeling)3個計算方法，對蛋白質分子的三維結構進行初步模擬。利用Swiss-ModelWorkspace在線分析工具(Schwedeetal.,2003;Guexetal.,2009;Johans-sonetal.,2012)，對擬南芥和蓖麻的VACVase-like蛋白的三級結構進行同源建模(圖6)，并應用Swiss-Pdb-Viewer(DeepViewv4.1)軟件顯示，結果表明，與人VACVase蛋白三級結構比較發現，蓖麻和擬南芥VACVase-like蛋白預測C-末端是一個典型的琢/茁水解酶的折疊結構，其中心的茁片層是由一組8個折疊股構成的，茁片層的兩側則分布有五個和六個的琢螺旋，N-端部分的氨基酸殘基同樣也參與琢/茁水解酶折疊結構域的形成，折疊結構是琢/茁水解酶超家族的典型的結構特征，琢/茁水解酶折疊的三個結構域區域都可以插入整個結構域或者一些片段，也可以相應的進行延長。從同源建模的結果得知，蓖麻和擬南芥VACVase-like蛋白氨基酸序列與參考蛋白的氨基酸序列的同源性較高均在50%以上，所得到的建模結果的準確性均較高。拉氏構象圖(theramachandrandiagram)主要是鑒定蛋白質的構象的合理性。對于一個三肽來說，當中心肽基處在所有漬角和鬃角值時計算非鍵合原子間的允許距離，通過在線軟件Swiss-PdbViewer分析預測的結果，通過分析Psi(鬃)角和Phi(漬)角的分布，可大致的評估模擬的結構域與自然結構的相同程度及合理性。圖7中的黃色區域是最理想的Phi(漬)角和Psi(鬃)角分布區域，而藍色區域外部則表示不合理區域(琢表示琢-螺旋,L琢表示左旋琢-螺旋,茁表示茁-折疊,pp域表示聚脯氨酸域)。預測的蛋白質的空間結構較是否穩定取決于蛋白質殘基的二面角(>90%)是否都位于黃色區域，如果預測的二面角均在黃色區域內，則同源建模的結果相對可靠。

1.9植物VACVase-like蛋白的保守序列分析利用在線工具MEMESuiteversion4.7.0(BaileyandElkan,1995)分別對植物VACVase-like蛋白進行了基序(motif)分析，在每個VACVase-like蛋白質中分別得到5個保守基序(表3)，N-端在不同植物中進化變異性較高，但N-端的氨基酸殘基也參與形成琢/茁水解酶折疊結構域，C-端則高度保守，是一個琢/茁折疊水解酶典型結構，且每個植物的保守區的位置基本相同(圖8;圖9)，表明該基因家族在進化過程中高度保守，說明VACVase-like基因家族在生物體中具有十分重要的作用。甜瓜(MELO3C009679P1)基序motif2和motif4在進化過程中缺失，可能在功能上有冗余。隨著選擇壓力的減小，每個基因積累各自不同的遺傳和變異，從而形成結構和功能不同的新基因。

2討論

VACVase在動物體內的肝臟、腎臟中表達量極高，而在心臟、腸道及骨骼肌中表達量極弱，證明該酶具有重要的解毒功能，對其特異性分析表明VAC-Vase是一個高度特定的氨基酸酯水解酶，但在植物體內的功能尚不清楚。本文通過生物信息學軟件和在線分析工具，對蓖麻、黃瓜、葡萄、可可樹、毛果楊、桃、草莓、大豆、鷹嘴豆、番茄、擬南芥和甜瓜等植物的VACVase-like蛋白進行分析。結果顯示，其穩定性發現除了可可樹穩定以外，其余均為不穩定的蛋白，其中黃瓜的VACVase-like蛋白最不穩定為51.30%，研究認為，不穩定指數>40%，說明該蛋白為不穩定。該蛋白家族除了甜瓜和人均含有信號肽結構，而VACVase-like基因編碼的蛋白存在導肽和跨膜結構，跨膜螺旋數目在3~5之間，也證明了信號肽結構的存在。在系統發生分析過程中，多數蛋白在進化上高度保守，且各分支上都存在直系同源關系，但是在各自的進化分支上仍然發現有物種內的獨特的旁系同源基因，可能在進化演變過程發生了獨立的基因重復事件，基因重復在演化過程中扮演重要角色，它與物種的分化、生物體基因組大小的進化、新基因的產生等都密切相關。從而產生了旁系同源基因，并且在功能上，由于進化提供了較合適且更多的選擇位點，當基因重復事件發生后，只要有一個基因是正常發揮功能，這些基因的復制品通常可幸免于選擇壓力或選擇壓力就會大大減少，當重復基因積累到一定程度便獲得新的功能，而且也是新基因產生的重要途徑之一(Forceetal.,1999)。桃和草莓、大豆和鷹嘴豆、番茄的兩個蛋白以及黃瓜和甜瓜的蛋白在不同物種間而進化過程中則高度保守，在進化上的親緣關系最近。可能是由同一祖先進化而來，但在物種分化后，在不同的選擇壓力下序列發生了不同方向的進化。雖然VACVase-like蛋白都屬于琢/茁折疊水解酶，導致在亞細胞中的定位存在一定的差異主要與其所處的空間位置和功能相關。高級結構分析表明，所有植物VACVase-like蛋白都由琢-螺旋、茁-折疊、茁轉角和無規則卷曲所組成且琢-螺旋和茁-折疊是主要的構成元件，三級結構中VAC-Vase-like蛋白C-末端是一個典型的琢/茁水解酶的折疊結構，其中心的茁片層是由一組8個折疊股構成的，茁片層的兩側則分布有五個和六個的琢螺旋，N-端是一個茁推進器結構，大約10~30個氨基酸殘基組成，該茁推進器結構也參與形成琢/茁水解酶折疊結構域，折疊結構是琢/茁水解酶折疊超家族的典型的結構特征。

3材料與方法

3.1數據來源選擇一個含有典型DUF1234/ABHYDROLASE-1結構域的蓖麻(ACCESSION:XP_002518915)和擬南芥(NP_194145)蛋白序列作為探針序列，在NCBI(NationalCenterForBiotechnologyInformation通過blastp檢索蛋白數據庫，選擇E臆10-10的序列為候選蛋白，再利用SMART(smart.embl-heidelberg.de/)在線軟件預測這些候選蛋白質的DUF1234/ABHYDROLASE-1結構域，若存在DUF1234/ABHYDROLASE-1結構域則認為該蛋白屬于琢/茁折疊水解酶家族的類伐昔洛韋水解酶，最終確定，黃瓜(XP_004143839)、葡萄(XP_002279898)、可可樹(EOY23882)、毛果楊(XP_0-02304581)、桃(EMJ10313)、草莓(XP_004309537)、大豆(XP_003535395)、鷹嘴豆(XP_004495509)、番茄(XP_004244657,XP_004245454)、擬南芥(NP_194145,AT1G64670)、甜瓜(MELO3C005787P1,MELO3C00-9679P1)和人(NP_004323)。

3.2類伐昔洛韋水解酶的生物信息學分析應用Expasy數據庫中的Protparam軟件分析預測候選蛋白的理化性質包括：氨基酸數目、分子量、理論等電點、分子式、消光系數、脂肪系數等。氨基酸的同源比對及構建進化樹應用MEGA5.10軟件分析。Protscale軟件預測其親水性，采用SMART在線軟件預測蛋白質的保守結構域，SignalPV2.0.b2預測可能的信號肽，TargetP1.1Server預測可能的前導肽，跨膜結構域的預測應用TMHMMServerv.2.0和Tmpred在線工具進行。二級結構預測由數據庫中的CFSSP(chou&fas-mansecondarystructurepredinctionserver)進行，三級結構由Swiss-Model進行同源模塊的構建，再用swiss-pdbviewer計算得出拉氏構象圖(Ramac-hand-ran)，以檢驗其合理性。利用在線工具MEMESuiteversion4.7.0分別對植物VACVase-like蛋白進行了基序分析。作者貢獻巴德仁貴完成論文構思、數據分析和寫作；李爽、王紹萌和馬勇參與論文的分析和修改；哈斯阿古拉是項目的支持人，完成論文的修改和最終定稿。致謝本研究由內蒙古自治區高等學校創新團隊發展計劃(No.NMGIRT1401)資助。

作者：巴德仁貴李爽王紹萌馬勇哈斯阿古拉單位：內蒙古大學生命科學學院/內蒙古自治區牧草與特色作物生物技術重點實驗室,