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《基因組學與應用生物學雜志》2015年第四期

1細菌耐藥性的演變(evolutionofantibioticresistance)

細菌獲得的耐藥性相關遺傳因素賦予了其耐藥性。根據(jù)相關研究，發(fā)現(xiàn)細菌耐藥性的演變過程大概經(jīng)歷了三個階段：抗生素使用之前，耐藥性從無到有的功能變異(exaptation)過程；抗生素引入臨床治療促進了耐藥性細菌的出現(xiàn)；抗生素的廣泛使用甚至濫用，導致多重耐藥細菌和超級細菌不斷出現(xiàn)。在人類使用抗生素之前，產(chǎn)抗生素細菌的前耐藥基因(pre-resistencegenes)就已經(jīng)進化了數(shù)百萬年。該類基因僅能夠?qū)ψ陨硭a(chǎn)抗生素具有解毒功能(detoxification)，而并不能對其它細菌所產(chǎn)的抗生素起解毒作用。當一些在原始微生物中發(fā)揮不同功能的基因轉(zhuǎn)移到新的細菌宿主中時，能賦予包括人類病原菌在內(nèi)的新宿主的耐藥性(Baqueroetal.,2009)。研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲腸道微生物的外排泵沒有外排抗生素的能力，但當它轉(zhuǎn)移至大腸桿菌時卻可以外排抗生素，從而賦予了細菌耐藥性(Kadavyetal.,2000;Allenetal.,2009)。一些原始細菌中的前耐藥基因并不發(fā)揮耐藥功能是由于其表達水平很低；但當這些基因轉(zhuǎn)移到新宿主中時，可能會整合在高拷貝的質(zhì)粒中或者強啟動子引發(fā)了它的高表達，因此表現(xiàn)出了耐藥性(Martinezetal.,1987;Martinezetal.,1989;DantSommer,2012)。類似于這種在原始宿主中并不表現(xiàn)出耐藥功能的基因，但當其轉(zhuǎn)移到人類病原菌等細菌中就可能成為耐藥相關基因，在這個過程中基因本身并沒有發(fā)生遺傳上的改變，僅僅是其所處的宿主環(huán)境發(fā)生了變化，將耐藥基因的這種演變方式稱為功能變異(exaptation)(uldVrba,1982)。

抗生素的廣泛使用明顯促進了耐藥突變體的出現(xiàn)。在無抗生素或低濃度抗生素條件下，敏感性菌株繁殖占優(yōu)勢，導致耐藥性細菌在生存競爭中很難被選擇下來；而當抗生素選擇壓力逐漸增大時，敏感性細菌的生長不斷受到抑制甚至被殺死，大大減小了耐藥性細菌的生存壓力(WaksmanWoodruff,1940;Mart侏nez,2008)。汪復研究了金黃色葡萄球菌的臨床分離株，發(fā)現(xiàn)其對紅霉素的耐藥率逐年上升(1972年為16.7%;1973年為47%;1977年為50%)；雖然所分離的大多數(shù)菌株對慶大霉比較敏感，但其對慶大霉素的耐藥率也呈上升趨勢(汪復,1983,江蘇醫(yī)藥,11:46-48)。妹等(1989)發(fā)現(xiàn)臨床分離的金黃色葡萄球菌除了對青霉素G等常用的抗生素具有較高的耐藥水平外，部分菌株還對頭孢呋新、頭孢噻肟和丁胺卡那霉素等較新的抗生素也出現(xiàn)了耐藥的現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，即使是亞抑制濃度的抗生素壓力，也能夠增加細菌DNA的突變頻率和基因水平轉(zhuǎn)移速率，促進了耐藥性突變體的出現(xiàn)和耐藥性的傳播(Beaberetal.,2004;Guerinetal.,2009;L佼pezBl佗zquez,2009;Kohanskietal.,2010;GillingsStokes,2012)。隨著抗生素大量使用及濫用，許多人類致病菌已經(jīng)演變成多重耐藥細菌。自20世紀70年代茁-內(nèi)酰胺類抗生素引入治療臨床感染后，銅綠假單胞菌、大腸桿菌、沙門氏菌等一些革蘭氏陰性致病的茁-內(nèi)酰胺酶種類明顯增加，目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有1000多種茁-內(nèi)酰胺酶(來自新型基因和它們的突變體)(Ja-coby,2009;BushJacoby,2010;Poireletal.,2010)。

基因水平轉(zhuǎn)移作用在細菌對茁-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性傳播過程中起重要作用(DaviesDavies,2010)。近年來，鮑曼不動桿菌的耐藥性發(fā)生了快速的演變，從2002~2011年，所檢測的菌株對氨芐西林、頭孢西丁、頭孢唑林等多種抗生素的耐藥率十年來均持續(xù)表現(xiàn)為100%，而對氨芐西林舒巴坦、阿莫西林克拉維酸、氨曲南、亞胺培南等多種抗生素的耐藥率從0.00%增長到高于50%(劉德華等,2015)，這表明鮑曼不動桿菌在抗生素壓力下耐藥性發(fā)生了快速的演變。此外，食物鏈的富集作用等人類活動也促進了細菌耐藥性的傳播與演變。2012年Jaing等人研究中國農(nóng)場使用抗生素養(yǎng)殖過的魚，在其腸道中分離出了含耐藥基因(qnrB,qnrS,blaCTX-M-14,blaCTX-M-79)的大腸桿菌，隨后在人體內(nèi)的大腸桿菌、克雷伯氏細菌中也發(fā)現(xiàn)了該類耐藥基因(Jiangetal.,2012)。這都說明抗生素的廣泛使用促進了細菌耐藥性的演變和傳播。

2細菌的耐藥機制(mechanismsofantibioticresistance)

那些最初并非發(fā)揮耐藥功能的基因，在包括人類病原菌在內(nèi)的細菌中經(jīng)歷了復雜的演變過程。隨著抗生素使用頻率的持續(xù)增加，引發(fā)了細菌的耐藥性問題并且該現(xiàn)象不斷加劇。細菌的耐藥機制成為了研究者們關注的焦點。通常情況下，對其耐藥機制的研究主要從抗生素鈍化酶、藥物作用靶點、多藥外排系統(tǒng)、膜的滲透性等方面著手。本文基于細菌耐藥性的起源與演變進程，根據(jù)細菌自身是否降低了抗生素的有效濃度/數(shù)量，對其耐藥機制進行討論。當細菌感受到抗生素壓力時，可以通過抗生素水解/鈍化酶或多藥外排泵降低抗生素的有效活性，提高細菌在抗生素環(huán)境下的生存能力。目前，研究者已經(jīng)闡明病原菌中有數(shù)千種降解或修飾抗生素的酶。銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌等攜帶編碼碳青霉烯酶的質(zhì)粒，介導細菌對該類抗生素的耐藥性(Tzou-velekisetal.,2012)；大腸桿菌編碼的CTX-M14和CTX-M15賦予其對頭孢菌素的耐受性(Poireletal.,2012;ZhaoHu,2013)。研究人員發(fā)現(xiàn)，大分子的氨基糖苷類抗生素對酶的修飾作用敏感性較高，細菌編碼的乙酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶以及核苷酸轉(zhuǎn)移酶可以對其進行修飾，使自身產(chǎn)生耐藥性(NorrisSerpersu,2013)。類似地，一些外排泵也可降低抗生素的有效活性。絕大多數(shù)微生物編碼的多藥外排泵具有廣泛的底物特異性，可以外排多種抗生素，阻止抗菌劑與其作用靶點的結合，從而使細菌產(chǎn)生了耐藥性。銅綠假單胞菌中MexAB-OprM外排泵對茁-內(nèi)酰胺類、喹喏酮類、磺胺類等多種抗生素具有外排功能，該外排泵在其內(nèi)在耐藥性方面起重要作用(Pid-dock,2006)；大腸桿菌中的AcrAB外排泵也具有類似的功能(Baucheronetal.,2014)。像抗生素修飾/鈍化酶、多藥外排泵這種能夠有效降低抗生素濃度/數(shù)量的耐藥機制被稱為主動耐藥機制(activemecha-nismsofresistance)(Mart侏nezBaquero,2014)，一般情況下這類耐藥元件可以通過無性繁殖或基因水平轉(zhuǎn)移獲得。在抗生素壓力下，細菌可通過改變與抗生素相互作用的靶點或降低能夠接觸的靶點抗生素有效濃度，提高細菌在抗生素環(huán)境下的適應性。通過分析臨床病原菌的耐藥原因，發(fā)現(xiàn)藥物靶點編碼基因的單位點發(fā)生突變，則可能產(chǎn)生耐藥性。利奈唑胺的作用靶點是革蘭氏陽性細菌核糖體23S亞基，它通過抑制mRNA與核糖體的結合，從而阻止細菌蛋白質(zhì)的合成抑制它的繁殖。若利奈唑胺作用靶點的編碼基因發(fā)生突變，則細菌可對該抗生素的產(chǎn)生抗藥性。在臨床利奈唑胺存在的條件下，肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌因23SrRNA基因突變引起耐藥性的突變株將會被選擇下來(Leclercq,2002;Gaoetal.,2010;Billaletal.,2011)。類似地，金黃色葡萄球菌mprF(編碼耐藥因子)位點的突變，導致膜和磷脂成分發(fā)生改變，降低了達托霉素破壞細菌細胞膜的能力，從而使其對該抗生素產(chǎn)生了耐藥性(Mishraetal.,2013)。類似地不改變抗生素活性可產(chǎn)生耐藥性的耐藥機制還有降低能夠接觸靶點的游離抗生素有效濃度?？椎鞍妆磉_的降低或多選擇通道(porinswithmore-selectivechannels)代替低滲透性孔蛋白，可降低能夠接觸靶點的游離抗生素有效濃度。一些缺乏碳青霉烯酶表達的腸桿菌科臨床菌株也可對碳青霉烯類抗生素產(chǎn)生耐受性，這是由于孔蛋白編碼基因或等位基因突變導致其表達降低，減少了靶點處游離抗生素的有效濃度(Wozniaketal.,2012;Baroudetal.,2013;Blairetal.,2015)，從而使其對該類抗菌藥物產(chǎn)生了耐受性。類似于抗生素作用靶點的改變，若編碼轉(zhuǎn)運蛋白或抗生素前體激活蛋白的基因發(fā)生突變，也能降低接觸靶點的游離抗生素有效濃度。像這種不改變抗生素活性，只是通過改變抗生素作用靶點或降低能夠接觸靶點的游離抗生素有效濃度(即膜滲透性降低)的耐藥機制被稱為被動耐藥機制(psivemechanismsofresis-tance)(Mart侏nezBaquero,2014)。這種耐藥性可通過無性繁殖進行傳播。多數(shù)情況下，突變的耐藥基因不能通過基因水平轉(zhuǎn)移進行傳播，然而，肺炎雙球菌中突變的拓撲異構酶的基因卻可以通過這種作用進行傳播(Ferr佗ndizetal.,2000)。除了主動和被動耐藥機制外，一些參與調(diào)節(jié)細菌基礎代謝的基因也會影響細菌對抗生素的敏感性(Mart侏nezRojo,2011)。在缺乏異檸檬酸鹽脫氫酶或順烏頭酸酶B的大腸桿菌中，通過改變呼吸鏈相關代謝途徑，使細菌對喹諾酮類抗生素產(chǎn)生耐受性(HellingKukora,1971;Grueretal.,1997)。此外，參與銅綠假單胞菌碳、氮源代謝的CbrA-CbrB雙組份系統(tǒng)也影響其對抗菌劑的敏感性(Yeungetal.,2011)。

3展望

目前，自然生態(tài)系統(tǒng)中細菌的耐藥性以及臨床菌株耐藥性傳播的決定因素等相關研究仍處于初級階段，前耐藥基因在原始宿主中是否具有耐藥功能仍不十分清楚?，F(xiàn)在，能夠支持耐藥基因起源于環(huán)境微生物以及它可轉(zhuǎn)移至病原菌，從而賦予病原菌耐藥性的相關研究尚不全面。大部分耐藥性起源以及演變的研究比較分散。研究者已經(jīng)逐漸開始在實驗室條件下模擬自然生態(tài)系統(tǒng)及人類病原菌耐藥性的演變進程，追蹤耐藥基因在抗生素環(huán)境下的進化軌跡，但在實驗技術上面仍臨著巨大的挑戰(zhàn)。此外，還有研究者建議分析致病性細菌的耐藥島，可進而闡述其耐藥性的獲得機制(盧新璞等,2012)。本文討論耐藥基因的起源與耐藥性的演變，以期望為研究細菌耐藥機理或者確定新的耐藥機制、預測細菌耐藥性的演變進程提供參考。

作者：王嚴寧喚喚梁鷹王波波李博沈立新單位：西北大學生命科學學院西部資源與現(xiàn)代生物技術省部共建教育部重點實驗室