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1材料與方法

1.1試驗材料(1)原料原料來自于寧夏固原的5年生檸條的平茬廢棄物，經自然曬干、粉碎后過10目與20目標準篩，選擇粒徑介于0.85～2mm之間的粉末作為實驗材料。(2)菌種微生物菌種選用模式菌黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)，購于美國標準生物品收藏中心(ATCC)，屬絲狀白腐真菌。(3)纖維素酶纖維素酶(固體)由寧夏夏盛實業集團有限公司惠贈，經測定其總纖維素酶活性(以濾紙為底物測定，pH4.8)約為64FPU/g。(4)培養基PDA培養基。檸條培養基按檸條︰自來水為1︰1.5(質量/體積比，m/v)的比例向檸條中加入自來水攪拌均勻制成，于121℃滅菌30min。

1.2試驗方法(1)堿處理堿處理采用0.1%～5%的NaOH溶液以1︰20固液比在100℃下處理15min，用蒸餾水對照。處理后用200目濾布過濾，收集濾液用H2SO4調節pH值至中性并測定濾液中還原糖含量，濾渣用自來水沖洗至中性后烘至恒重。(2)酸處理酸處理采用0.025%～1%的硫酸以1︰20固液比在120℃下處理1h，用蒸餾水做對照。處理后用200目濾布過濾，收集濾液用NaOH調節pH至中性并測定濾液中還原糖含量，濾渣用自來水沖洗至中性后烘至恒重。(3)微生物處理將菌種接種至PDA培養基上于28℃活化5～7天，活化后采用固體接種的方法挑取直徑為2～3mm的菌苔接種到檸條培養基上，每瓶接10塊。接種后置于28℃培養，分別在第3～6周取樣，于105℃干燥4h。(4)酶解糖化采用醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.8)于50℃溶解固體纖維素酶，酶濃度為1.25g/mL。稱取0.160g預處理前后的樣品，按每克生物質20FPU加入纖維素酶酶液，并用于pH值為4.8的醋酸－醋酸鈉緩沖液補充至反應體系總體積為8mL，于48℃靜置酶解48h后用定性濾紙過濾，棄濾渣，采用DNS法［13］測定濾液中還原糖含量。(5)木質纖維素含量測定參照NREL的方法［14］測定纖維素、酸不溶木質素(AIL)、酸溶性木質素(L)和木質素(AIL+L)含量，半纖維素含量采用中性洗滌纖維及酸性洗滌纖維法［15］測定。(6)轉化率與總還原糖得率的計算濾渣酶解糖化情況用轉化率表示，以酶解轉化出的還原糖質量占酶解前生物質質量百分比表示，轉化率/%=酶解轉化的還原糖質量÷酶解前稱取的樣品質量×100%總還原糖包含酸/堿水解出的還原糖及酶解產糖，以酸/堿水解產生的還原糖與酶解轉化產生的還原糖質量之和占酶解前生物質質量百分比表示，總還原糖利率/%=(酸/堿水解產生的還原糖質量+酶解轉化的還原糖質量)÷酶解前稱取的樣品質量×100%

1.3數據的統計分析方法采用Excel和SPSS19.0統計軟件對實驗數據進行分析，結果以平均值±標準誤差(M±SE)表示，對不同預處理的結果進行統計學Duncan檢驗比較差異，不同處理間的差異(p＜0.05)以小寫字母表示。

2結果與分析

2.1不同預處理后樣品質量損失和酶解轉化效率變化預處理是生物質轉化利用的必要手段，其主要目的是通過預處理破壞木質纖維素的復雜結構，降低纖維素結晶度，提高纖維素酶的效率［16］。預處理過程中，不同方式對酶的催化作用有著不同的效果，酶解轉化效率能有效表征不同樣品對纖維素酶的敏感程度。轉化率反映了單位質量生物質酶解釋放可發酵糖的能力，因此以轉化率表示不同預處理方法對生物質的改性程度。為了評價3種預處理方法對檸條酶解效果的差異，比較了預處理前后檸條的轉化率變化情況，同時考查了預處理對樣品重量的影響，結果見圖1～3。經不同濃度稀H2SO4處理的樣品失重率與酶解轉化率如圖1所示。由圖1可以看出，稀硫酸處理導致檸條重量損失顯著，樣品失重率隨稀H2SO4濃度增加呈上升趨勢，硫酸處理后固體殘渣的酶解轉化率與硫酸濃度無顯著相關性。稀硫酸能夠有效去除木質纖維素中的半纖維素成分，因此0.1%H2SO4處理即可引起檸條失重率達15.1%，處理程度增加也會導致部分纖維素組分的水解，1%硫酸處理時失重率達到40.8%。從酶解轉化率來看，一定濃度的稀硫酸預處理雖然能夠促進檸條酶解糖化，但對檸條酶解效率的提高幅度不大，小于0.5%的硫酸處理時，酶解效率隨硫酸濃度增加而升高;經0.5%H2SO4處理后的固體殘渣酶解效率提高最顯著，酶解轉化率比對照提高了20.3%;但隨著硫酸濃度進一步提高，半纖維素被消化的越多，固體殘渣中木質素含量相對升高，不利于酶解，酶解效率反而降低。因此，0.5%H2SO4是檸條酸法預處理的適宜濃度。經不同濃度NaOH處理的樣品失重率與酶解轉化率變化如圖2所示。從失重率的變化可以看出，隨著NaOH濃度的升高檸條失重率逐漸升高，當NaOH濃度提高至2.5%時，繼續提高NaOH處理的濃度，檸條的失重率基本維持不變。轉化率隨NaOH處理濃度的變化顯示，堿處理能夠顯著提高檸條酶解轉化率，轉化率隨堿用量增加而持續升高，5%NaOH處理后的檸條酶解轉化率最高，比未經處理的原材料提高了147.3%，達13.6%。經黃孢原毛平革菌處理不同時間的樣品失重率與酶解后還原糖轉化率如圖3所示。由圖3可知，白腐真菌處理后檸條平茬廢棄物的失重率持續升高，最高為處理6周的樣品，失重率達42.4%;酶解轉化率也均顯著高于對照，最高的是處理6周的樣品，比未經處理的原料提高了48.6%，其次是處理3周的樣品提高了38.1%。因此，白腐真菌處理6周是檸條平茬廢棄物微生物法預處理的適宜時間。綜合比較圖1～3可以發現，從處理后固體殘渣的酶解轉化效率來看，三種預處理方法對酶解效率的影響程度順序是:堿＞白腐真菌＞酸;其中，5%NaOH處理后樣品的轉化率最高，達13.6%，比原材料提高了147.3%。

2.2預處理前后檸條的木質纖維素含量為探究各樣品酶解轉化率提高的關鍵因素，進一步測定了原料和經不同預處理后樣品的木質纖維素成分，各組成分含量見圖4。從圖4可以看出，檸條平茬廢棄物的半纖維素、纖維素和木質素等3種主要成分占90%以上，近似于木材，其中半纖維素含量最高達34.1%，其次是木質素32.7%。檸條中的可轉化底物(纖維素與半纖維素)含量略高于玉米(Zeamayz)秸稈［17］，具有潛在的能源化利用價值。檸條為多年生灌木樹種，其木質素含量遠高于1年生的玉米秸稈，也高于多年生常綠樹種毛竹(Phyllostachysheterocyclacv.pubescens)［18］，不利于可轉化底物的釋放和利用，這是檸條作為飼料的利用率低下的關鍵原因。檸條的高木質素含量可能與檸條生長在干旱半干旱的環境有關，研究表明干旱脅迫時植物可以通過提高木質素含量來減少水分損失，抵御干旱帶來的不利影響。2#和3#為硫酸處理后的樣品，硫酸處理后檸條中的纖維素和木質素含量升高，而且隨著處理強度增加，硫酸對纖維素的水解程度增加，半纖維素含量顯著降低，其中樣品3#的半纖維素含量最低，為2.4%，比對照降低了93.0%，說明0.5%硫酸處理已經基本完全除去了檸條中的半纖維素，進一步增加硫酸濃度對預處理效果影響不大。4#～6#為堿處理的樣品，經堿處理后，檸條中纖維素含量顯著升高，酸不溶性木質素AIL含量顯著降低，其中，樣品6#的纖維素含量最高，達50.2%，AIL木質素含量最低，為21.0%，說明2.5%NaOH處理能夠有效去除檸條中木質素，導致纖維素含量相對增加。經白腐真菌處理后，纖維素和半纖維素含量均降低，說明白腐真菌降解檸條中的纖維素與半纖維素來獲得營養物質;L含量顯著高于所有處理后樣品及原料，說明白腐真菌能使檸條木質素顯著改性，該過程主要是以微生物胞外酶為主導的酶促反應，條件溫和，速度緩慢。不同預處理后檸條中的半纖維素含量均顯著降低，L含量均有所增加，說明檸條中的半纖維素比較容易被破壞，不同預處理均能改性木質素。結合不同預處理后酶解轉化率和主要成分的變化情況可以發現，預處理后木質素的脫除與改性是提高檸條酶解效率的關鍵因素。

2.3不同預處理樣品的總還原糖得率除酶解轉化率外，樣品的質量損失在預處理方法評價中也是需要考慮的重要因素，因為幾乎所有的木質纖維素預處理方法都無法避免樣品質量損失，造成可轉化底物的流失。總還原糖得率以預處理前生物質質量為基礎，綜合考慮預處理后從液體部分和固體部分酶解所獲取的總還原糖量。總還原糖得率的計算過程引入了預處理引起的質量損失，能夠從可轉化物質產出的角度綜合評價不同預處理方法。稀硫酸處理樣品后，半纖維素(主要多糖是木聚糖)被水解生成單糖和可溶性低聚糖［20］，因此水解液中會含有木糖等還原糖，經稀H2SO4處理后總還原糖得率需要同時考慮水解液中糖得率和濾渣經酶解后糖得率。收集水解液用DNS法測其中還原糖含量并根據處理前樣品質量計算水解液中還原糖得率，結果見圖5(A)。由圖5(A)可知，稀硫酸處理水解液中還原糖得率也隨H2SO4濃度增大而增加。H2SO4濃度從0.1%增加到0.5%時，水解液中還原糖得率增加顯著;當H2SO4濃度達到0.5%以后，繼續增加其濃度，水解液中還原糖得率提高不大。結果表明，當H2SO4濃度達到0.5%時，增大其濃度樣品中基本無還原糖繼續釋放，可能是因為在此處理濃度下半纖維素已經基本水解完全，繼續增加處理強度只能引起部分纖維素非結晶區的水解。合并H2SO4處理后水解液中還原糖得率和濾渣經酶解后的還原糖得率，即為不同濃度稀H2SO4處理后的總還原糖得率，結果見圖5(B)。由圖5(B)可知，當H2SO4濃度在0～0.5%之間時，增加其濃度，所對應的總還原糖得率也隨之增大而且增加速度較快;當H2SO4濃度大于0.5%時，繼續增加H2SO4濃度，總還原糖得率變化不顯著。H2SO4濃度為0.5%時總還原糖得率最高，為17.9%，是未處理原料的3.3倍。經NaOH處理后，濾液中主要為木質素水解的產物，經測定其中基本不含有糖類物質，因此，堿處理樣品的總還原糖全部來源于處理后濾渣用纖維素酶水解產生的糖，總還原糖得率見圖6。由圖6可知，0.5%～5.0%NaOH處理能有效提高檸條的總還原糖得率，濃度為0.5%和1%NaOH處理后樣品的總還原糖得率最高，達8.5%，比對照提高了55.6%;其次是經濃度為5%和2.5%NaOH處理后的樣品。白腐菌處理后樣品總還原糖得率變化情況見圖7。由圖7可以看出，白腐菌處理3周的樣品總還原糖得率最高，為5.8%，但與對照相比沒有顯著性差異;延長生物處理時間到4～6周后，總還原糖得率降低且顯著低于未經處理的對照樣品。這可能是由于白腐菌在破壞生物質結構的過程中，通過分泌胞外纖維素酶水解其中的纖維素，獲得葡萄糖作為碳源和能源，導致處理后樣品的可水解底物減少，致使總還原糖得率不斷降低。綜合分析比較圖5～7可知，3種預處理方法對于檸條平茬廢棄物總還原糖得率的影響程度排序是，酸＞堿＞白腐真菌;其中，0.5%H2SO4處理后總還原糖得率最高，可達17.9%，比未處理原料提高2.3倍。

3結語

檸條是適宜于北方和西北干旱半干旱地區培育的灌木樹種［2］，富含纖維素和半纖維素，具有較高的飼用價值，亦可作為干旱地區的特色能源原料。但是，檸條中木質素含量高，對外界因素的抗逆性強，不利于可轉化底物的釋放和充分利用，需要尋求有效的方式進行預處理以提高檸條的利用率，拓展其應用范圍。本項研究表明，稀硫酸處理后檸條的總還原糖得率是原料的3.3倍，預處理效果最好，顯著高于堿法和微生物法。硫酸處理后水解液中釋放出大部分的半纖維素來源的糖，固體殘渣的酶解效率亦有所提高，酶解后殘渣主要為木質素，熱值高，可作燃料，也可開發出其它高附加值產品。此外，測試表明檸條偏酸性，有利于酸處理過程中減少酸用量，但堿處理時用堿量大。因此，從可轉化底物的獲取來看，稀硫酸處理是檸條平茬廢棄物最佳的預處理方式。本研究從能源底物釋放方面比較了幾種預處理方式并獲得了最適宜的方法為稀硫酸預處理，但尚未涉及其工藝條件的優化，后續稀硫酸預處理的工藝優化及復合預處理方式促進檸條能源化利用的研究正在進行。在飼料領域，消化率低下是導致檸條作為飼料利用量小的直接原因［6］，堿處理和白腐真菌預處理均能有效提高檸條的酶解效率，因此可以考慮在檸條貯存過程中引入微生物和堿來提高檸條的利用效率。采用微生物處理通過菌種酶系的作用降解與改性檸條中木質纖維素成分，結合堿法處理能夠有效地脫除檸條中的木質素，不但能夠提高檸條在動物體內的消化率，而且有利于改善檸條的適口性，增加其營養價值。

作者：徐春燕姚福軍張娜單位：寧夏大學生命科學學院西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室