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《生物技術(shù)通報雜志》2014年第七期

1材料與方法

1.1材料

供試麻瘋樹（JatrophacurcasL.）種子源自四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物生理與分子生物學(xué)實驗室（林宏輝教授惠贈）。

1.2方法

1.2.1鹽脅迫處理播種前麻瘋樹種子用0.1mol/LKMnO4溶液浸泡種子5min進行消毒，并用清水浸泡12h，然后沙層催芽。種子萌發(fā)后選取長勢一致的幼苗以每盆1顆移入含營養(yǎng)土和蛭石（1∶1）的培養(yǎng)基質(zhì)上種植，同時每天施以1/2Hoagland營養(yǎng)液，兩真葉期幼苗用于鹽脅迫試驗。鹽脅迫處理時，先用200mmol/L、400mmol/L和1mol/LNaCl水溶液進行土壤灌澆，然后將整個花盆苗置于含200mmol/L、400mmol/L和1mol/LNaCl水溶液的托盤中培養(yǎng)，每天上、下午對托盤中的鹽溶液進行更換；對照組幼苗用去離子水處理。實時記錄不同處理組幼苗的生長變化情況。

1.2.2AOX基因的RT-PCR擴增分析麻瘋樹葉片總RNA的提取參照林莎等［21］的方法進行。不同處理組RNA濃度經(jīng)紫外分光光度計（TU-1800）檢測后，取1μg總RNA，用FirstStrandcDNAsythesisKit（Fermentas公司），反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。AOX基因RT-PCR擴增引物參照NCBI數(shù)據(jù)庫中的已知序列（NCBI登錄號：GW876353.1）進行設(shè)計，上游引物：5''''-CGATGGCTCTTTCACCTT-3''''；下游引物：5''''-CGCAATAGTTTCCAGCAC-3''''。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，采用Quantityone4.62軟件（Bio-Rad公司）進行半定量分析。

1.2.3呼吸測定麻瘋樹葉片呼吸測定參照Xu等［10］的方法用Clark型氧電極（Hansatech，King’sLynn，UK）進行總呼吸，細胞色素途徑呼吸和抗氰呼吸的測定和計算。無呼吸抑制劑時測得總呼吸速率；同時加入細胞色素途徑抑制劑KCN（氰化鉀，終濃度為1mmol/L）和交替途徑抑制劑n-PG（沒食子酸丙酯，終濃度為100μmol/L）測得剩余呼吸速率；僅加入KCN時的呼吸速率減去剩余呼吸速率為交替途徑呼吸速率。每個樣品重復(fù)測定3次，取平均值。

1.2.4葉綠素含量的測定葉綠素含量的測定參照Xu等［10］的方法進行。

1.2.5含水量測定取約1g麻瘋樹幼苗葉片，用電子天平稱重，記錄為Wf。將稱重后的葉片裝入兩個潔凈培養(yǎng)皿中，在120℃烘箱中干燥處理約50min。取出稱重后，再放回烘箱，之后間隔約10min稱重一次，直至恒重，記錄為WD．

1.2.6丙二醛和過氧化氫含量測定丙二醛（MDA）含量和過氧化氫（H2O2）含量的測定參照Wang等［22］的方法進行。

1.2.7氣孔觀測分別撕取對照組和鹽脅迫條件下的麻瘋樹幼苗葉片，制作葉表皮臨時裝片。氣孔用兩滴KI-I2染色后，置顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.2.8數(shù)據(jù)分析所有的數(shù)值都重復(fù)測定3次，并計算標準偏差（standarddeviation，SD）。采用GraphpadPrism6.0軟件分析數(shù)值的變化。以最小顯著差異值（leastsignificantdifference，LSD）0.05判斷各種結(jié)果差異是否顯著。

2結(jié)果

2.1不同濃度鹽脅迫對麻瘋樹生長的影響如圖1-A所示，麻瘋樹幼苗在200mmol/L和400mmol/LNaCl脅迫條件下生長良好，且當(dāng)鹽濃度提高到1mol/LNaCl處理時，麻瘋樹仍未表現(xiàn)出明顯的脅迫損傷，表明麻瘋樹具有較強的耐鹽適應(yīng)能力。進一步研究發(fā)現(xiàn)，3種濃度鹽脅迫處理3d后，麻瘋樹葉片葉綠素含量與對照組相比無顯著差別。此外，鹽脅迫處理對葉片含水量的影響也不明顯，處理組和未處理組麻瘋樹葉片含水量均在90%左右，表明麻瘋樹在鹽脅迫條件下具有較強的光系統(tǒng)保護能力和調(diào)節(jié)水分平衡的機制。3種濃度鹽脅迫處理3d后，葉片過氧化氫（H2O2）含量與鹽脅迫處理濃度呈正相關(guān)，但與對照組幼苗相比并無顯著差別。同樣，丙二醛（MDA）含量也隨著脅迫處理所用鹽濃度的上升而增加，但不同處理組之間沒有明顯差異，與對照組的差異也不顯著（圖1）。這些結(jié)果表明，麻瘋樹具有較強的鹽脅迫適應(yīng)機制。但是，高濃度鹽（1mol/LNaCl）脅迫處理條件下，麻瘋樹幼苗的生長速率變緩。1mol/LNaCl處理麻瘋樹幼苗10d后，葉片面積明顯小于未處理的對照組（表1）。

2.2鹽脅迫對AOX呼吸和AOX基因表達的影響AOX途徑已被證實在植物逆境脅迫響應(yīng)中扮演著減輕脅迫損傷、穩(wěn)定植物生長速率和增加植物抵御能力的作用，本研究進一步檢測了鹽脅迫處理對AOX呼吸和AOX基因表達的影響。圖2-A顯示，鹽脅迫條件下，麻瘋樹葉片總呼吸被不同程度抑制。與對照組幼苗相比，400mmol/L和1mol/LNaCl處理組葉片總呼吸下降最為明顯，但在處理后第2天趨于穩(wěn)定。相反，AOX呼吸在鹽脅迫處理條件下被顯著誘導(dǎo)（圖2-B）。在正常生長條件下，AOX呼吸約占總呼吸的28%。200mmol/LNaCl處理1d后，AOX呼吸約占總呼吸的40%。更明顯的是，400mmol/L和1mol/LNaCl處理1d后，AOX呼吸占總呼吸的比例超過了50%。此外，圖2-C顯示，鹽脅迫處理明顯誘導(dǎo)了AOX基因的轉(zhuǎn)錄。與對照組相比，200mmol/L和400mmol/LNaCl處理3d后，AOX基因的轉(zhuǎn)錄水平上升近兩倍。1mol/LNaCl處理后，AOX的轉(zhuǎn)錄水平上升近3倍。因此，AOX呼吸途徑的誘導(dǎo)表達可能是麻瘋樹具有耐鹽脅迫能力的原因之一。

2.3鹽脅迫處理后葉片氣孔比較分析為進一步分析麻瘋樹的鹽脅迫反應(yīng)，本研究還檢測了鹽脅迫處理對氣孔開合度的影響。結(jié)果（圖3）表明，200mmol/LNaCl處理時，麻瘋樹葉片氣孔大小與對照組幾乎相同。400mmol/LNaCl處理時，麻瘋樹葉片氣孔開度明顯減小。當(dāng)鹽濃度提高到1mol/LNaCl處理時，麻瘋樹葉片氣孔大部分處于半閉合狀態(tài)。因此，麻瘋樹可能通過調(diào)節(jié)氣孔開合度來維持葉片較高的含水量，這可能也是麻瘋樹具有較高耐鹽性的原因之一。

3討論

麻瘋樹耐貧瘠，生命力旺盛，根系強大，能在降水量少、環(huán)境惡劣的地區(qū)種植，但到目前為止麻瘋樹的抗逆機理仍不清楚。本研究通過檢測不同濃度鹽脅迫處理對麻瘋樹生長的影響及交替氧化酶在鹽脅迫條件下的表達變化，以期進一步揭示麻瘋樹對逆境脅迫的耐受機制。研究結(jié)果表明，麻瘋樹在200mmol/L、400mmol/L和1mol/LNaCl處理條件下均表現(xiàn)出較強的耐鹽適應(yīng)性。麻瘋樹幼苗在200mmol/L和400mmol/LNaCl處理條件下生長狀況良好，長勢幾乎與對照組相同。1mol/LNaCl處理減緩了麻瘋樹幼苗的生長速率，但并沒有造成明顯的脅迫損傷。陳健妙等研究表明，100-150mmol/LNaCl處理對麻瘋樹幼苗的長勢影響不大，且低濃度鹽處理（20-50mmol/LNaCl）還能促進麻瘋樹幼苗的生長和生物量的積累。本研究也發(fā)現(xiàn)，3種濃度鹽脅迫條件下，麻瘋樹幼苗葉片葉綠素、H2O2和丙二醛含量與對照組相比并無顯著差異。

此外，本研究表明麻瘋樹在鹽脅迫條件下具有較強的水分調(diào)節(jié)能力。試驗期間，脅迫處理組和對照組麻瘋樹幼苗葉片細胞含水量均維持在一個較高的水平。據(jù)此，我們分析可能與調(diào)節(jié)氣孔開合度有關(guān)，麻瘋樹幼苗在200mmol/LNaCl處理條件下葉片氣孔開合度與對照組沒有太大差異，但用400mmol/LNaCl和1mol/LNaCl處理時，氣孔開度明顯減小，尤其是在1mol/LNaCl處理條件下，氣孔大多處于半閉合狀態(tài)。前人的研究也表明麻瘋樹具有較強的抗?jié)B透脅迫能力。竇新永等曾報道麻瘋樹幼苗在高濃度的PEG（25%）處理15d后仍能存活，表明其具有對干旱缺水的環(huán)境有較強的適應(yīng)性。陳友根等也曾報道，適度的滲透脅迫不會影響麻瘋樹的生長，反而會增強細胞葉綠素的合成。1mol/LNaCl處理的麻瘋樹幼苗葉片面積明顯小于對照組幼苗。葉面積的減少可降低相對蒸騰速率，從而減少水分散失；加上氣孔開度的減小，麻瘋樹能較好地維持葉片的相對含水量。但是，高濃度鹽處理引起的葉片氣孔開度的減小可能是植株生長減緩、葉面積降低的主要原因。因此，鹽脅迫對麻瘋樹的作用是多方面的，麻瘋樹在抗鹽反應(yīng)過程中自身代謝反應(yīng)也受到了影響。

麻瘋樹對鹽脅迫的適應(yīng)性還應(yīng)與AOX呼吸途徑有關(guān)。本研究顯示，3種濃度鹽脅迫處理條件下，葉片細胞總呼吸受到了不同程度的抑制，但AOX途徑呼吸和AOX基因轉(zhuǎn)錄水平明顯上升。高濃度鹽處理（400mmol/L和1mol/LNaCl）1d后，AOX呼吸占總呼吸的比例超過了50%。此外，200mmol/L和400mmol/LNaCl處理3d后，AOX基因的轉(zhuǎn)錄水平高出對照組幼苗近兩倍。當(dāng)用1mol/LNaCl處理3d后，AOX基因的轉(zhuǎn)錄水平較對照組上升近3倍。這些結(jié)果表明，鹽脅迫誘導(dǎo)AOX的表達可能是麻瘋樹對鹽脅迫高度適應(yīng)的另一原因。事實上，近年來國內(nèi)外的一系列研究表明AOX在鹽脅迫條件下扮演著至關(guān)重要的角色，且鹽脅迫誘導(dǎo)AOX基因表達已在擬南芥、煙草、黃瓜、番茄等諸多植物中得以證實。研究人員在這些植物的抗逆應(yīng)答研究中發(fā)現(xiàn)，AOX表達的上升有助于減少脅迫條件下活性氧（ROS）的積累，減輕氧化損傷，從而維持植物的正常代謝生長。Xu等研究表明，脅迫條件下AOX表達上升還有助于減輕逆境脅迫對光系統(tǒng)的損傷，使植物保持正常的光合效率。由此可見，本試驗中AOX基因表達的上升可能與減輕鹽脅迫引起的氧化損傷有關(guān)。此外，越來越多的研究把AOX當(dāng)作細胞氧化損傷的標記基因，甚至視為植物的“存活因子”。例如，擬南芥植物過表達AOX基因能顯著增強植物在逆境條件下的存活率；相反，沉默或抑制AOX基因表達的植株在脅迫條件下表現(xiàn)出嚴重的細胞損傷，逆境適應(yīng)性大大減弱。因此，麻瘋樹幼苗AOX呼吸途徑的上升在一定程度上彌補了鹽脅迫對細胞色素途徑呼吸的影響，穩(wěn)定了線粒體中正常的電子傳遞，從而減少脅迫引起的氧化損傷。本研究表明麻瘋樹具有較強的耐鹽適應(yīng)性，AOX基因也在麻瘋樹鹽脅迫應(yīng)答過程中受明顯的誘導(dǎo)表達。但是，交替氧化酶的誘導(dǎo)機制是什么，及與其它抗逆因子間存在怎樣的關(guān)系，尚需進一步研究證明。此外，麻瘋樹在鹽脅迫條件下氣孔導(dǎo)度的調(diào)節(jié)機制是什么，是否與脫落酸（ABA）和乙烯等抗逆激素有關(guān)，加強相關(guān)的研究有助于進一步闡明麻瘋樹的耐鹽機理。

4結(jié)論

研究了鹽脅迫處理對麻瘋樹生長的影響及AOX在麻瘋樹鹽脅迫響應(yīng)中的作用。結(jié)果表明，麻瘋樹具有較強的耐鹽性，200mmol/L和400mmol/LNaCl處理對麻瘋樹幼苗生長影響不大。1mol/LNaCl處理時麻瘋樹生長減緩，氣孔開度降低，但未表現(xiàn)出明顯的脅迫損傷。此外，AOX呼吸和AOX基因的轉(zhuǎn)錄水平在鹽脅迫條件下明顯上升，表明AOX可能在麻瘋樹鹽脅迫應(yīng)答過程中起重要作用。

作者：余璐璐吳陽晨王靜靜 魏倩 徐飛單位：武漢生物工程學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院