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《獸類學報》2018年第1期

【摘要】目的探討使用他克莫司（FK506）的大鼠體內短鏈脂肪酸（SCFA）的變化及其對血糖水平的影響。方法將10只SD大鼠分為FK506組和對照組，每組各5只。FK506組給予每日皮下注射FK506（3mg/kg）+含10%乙醇的葵花油溶液，持續(xù)4周；對照組給予皮下注射等量的含10%乙醇的葵花油溶液，持續(xù)4周。給藥期間每周測量2組大鼠體質量。給藥結束后，檢測兩組大鼠的血糖水平、血液和糞便中的SCFA含量。結果與對照組比較，第2、3、4周FK506組大鼠的相對體質量均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均為P<0.01）。與對照組比較，F(xiàn)K506組大鼠在給予葡萄糖后0、30、60min時血糖水平均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01～0.05）。與對照組比較，F(xiàn)K506組大鼠糞便中乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸含量均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01～0.05）。結論FK506可導致大鼠血糖水平升高，這種升血糖的作用可能由大鼠糞便SCFA含量降低引起。

【關鍵詞】大鼠；他克莫司；血糖；短鏈脂肪酸；體質量；移植術后糖尿病；腸道菌群

移植術后糖尿病（post-transplantdiabetesmellitus,PTDM）是實體器官移植術后的重要并發(fā)癥，腎移植術后1年內PTDM的發(fā)生率約為30%～50%，可明顯影響移植物的存活[1]。除肥胖、家族遺傳史等因素外，腎移植術后長期使用免疫抑制劑也是導致PTDM發(fā)生的主要原因[2-4]。Karlsson等[5]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者與非糖尿病患者的腸道菌群有差異，與非糖尿病患者相比，糖尿病患者腸道菌群的厚壁菌門菌明顯減少。越來越多的研究也表明，腸道菌群可通過代謝產物短鏈脂肪酸（shortchainfattyacids，SCFA）來影響血糖代謝[6-8]。目前，關于腎移植受體術后服用他克莫司（FK506）與受體體內SCFA變化的相關研究較少。本研究分析注射FK506大鼠的體內SCFA和血糖的變化，旨在探討FK506對SCFA和血糖代謝的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物

健康雄性SD大鼠10只，周齡6～7周，體質量200～250g，購自成都達碩實驗動物有限公司。購入后飼養(yǎng)于四川大學華西醫(yī)院實驗動物中心，環(huán)境符合清潔級標準，用標準大鼠飼料喂養(yǎng)，自由飲水。動物實驗取得四川大學實驗動物倫理委員會審批同意。

1.2主要試劑和儀器

FK506購自杭州中美華東制藥有限公司，10%葡萄糖注射液購自四川科倫藥業(yè)股份有限公司，乙醚購自成都國藥集團西南醫(yī)藥有限公司，電子秤、血糖檢測儀購自長沙三諾生物傳感股份有限公司，氣相色譜–質譜法聯(lián)用儀（gaschromatography–massspectrometry，GC-MS）購自美國ThermoFisherScientific公司。

1.3實驗分組與干預方法

將10只大鼠分為FK506組和對照組，每組各5只。FK506組：FK506（3mg/kg）+含10%乙醇的葵花油溶液每日皮下注射，持續(xù)4周。對照組：等量含10%乙醇的葵花油溶液皮下注射，持續(xù)4周。

1.4檢測指標

1.4.1體質量及血糖水平監(jiān)測

給藥期間每周測量2組大鼠體質量（相對體質量＝該周體質量/給藥前體質量）。2組大鼠給藥4周結束后禁食過夜，第2日早上再次給藥，2h后腹腔注射1mg/kg的葡萄糖溶液，分別在0、30、60、90、120min尾靜脈采血，血糖檢測儀檢測樣本中的血糖水平。

1.4.2SCFA含量檢測

血液樣品（100μL）加入1mL乙醚萃取15min，低溫離心分離（22000×g，10min，4℃），取乙醚相進樣分析。糞便樣品（1g）加入3mL鹽酸水溶液，均質機上均質5min，然后離心分離取上清液，加入1mL乙醚萃取15min，低溫離心分離（22000×g，10min，4℃），取乙醚相進樣分析，使用GC-MS儀進行定量測定SCFA。1.5統(tǒng)計學方法采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內前后比較采用配對t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1兩組大鼠相對體質量和血糖的比較

兩組大鼠給藥期間的相對體質量變化見圖1。對照組大鼠第2、3、4周的相對體質量明顯高于第1周（均為P<0.01），而FK506組大鼠第3、4周的相對體質量明顯低于第1周（P<0.01～0.05）。與對照組比較，第2、3、4周FK506組大鼠的相對體質量均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均為P<0.05）。兩組大鼠給藥4周后血糖水平變化見圖2。注射葡萄糖后0、30、60min時，F(xiàn)K506組大鼠的血糖水平均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01～0.05），注射葡萄糖后90、120min時，兩組的血糖水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均為P>0.05）。

2.2兩組大鼠體內SCFA含量的比較

兩組大鼠血液樣本中SCFA變化見圖3。與對照組比較，F(xiàn)K506組大鼠血液中丁酸、異戊酸和戊酸含量略有升高，但差異均無統(tǒng)計學意義（均為P>0.05）。對照組大鼠血液中未檢測出甲酸、乙酸、丙酸和異丁酸（即在檢測臨界值下），F(xiàn)K506組大鼠血液樣本中未檢測出甲酸，僅有1只大鼠血液中檢測出乙酸、丙酸和異丁酸。兩組大鼠糞便樣本中SCFA變化見圖4。與對照組比較，F(xiàn)K506組大鼠糞便中乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸含量均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01～0.05）。對照組和FK506組大鼠糞便中未檢出甲酸。以上結果表明，F(xiàn)K506給藥后大鼠糞便中SCFA含量明顯降低。

3討論

腎移植受體術后長期聯(lián)合使用鈣神經蛋白抑制劑（CNI）+嗎替麥考酚酯（MMF）+腎上腺皮質激素的免疫抑制方案是PTDM的主要危險因素，CNI中的FK506較環(huán)孢素（CsA）更易導致PTDM發(fā)生[2,9-10]。Gnatta等[3]發(fā)現(xiàn)服用FK506的腎移植受體的PTDM發(fā)生率為24.6%，而服用CsA的腎移植受體則為17.2%。腸道中的SCFA主要由遠端結腸細菌發(fā)酵粗纖維食物產生，通過結腸上皮細胞表面表達的單羧酸轉運蛋白Ⅰ和鈉耦合單羧酸轉運蛋白Ⅰ轉運進入血液循環(huán)，可直接影響外周組織的代謝和功能[11-12]。SCFA中90%～95%為乙酸、丙酸和丁酸，可參與糖代謝并預防胰島素抵抗，其中乙酸是膽固醇合成的底物，可通過中樞下丘腦機制抑制食欲，丙酸是蛋白質、糖、脂肪合成的前體，丁酸是結腸上皮的主要能量來源[13-15]。Fernandes等[16]對正常對照和高胰島素血癥的受試者靜脈注射乙酸，發(fā)現(xiàn)乙酸可使體內游離脂肪酸下降，且游離脂肪酸的下降水平與胰島素抵抗水平呈負相關，表明乙酸可減少脂類分解并改善胰島素抵抗。Perry等[17]發(fā)現(xiàn)乙酸可通過激活副交感神經，從而促進胰島素和生長激素的分泌。SCFA對于血糖的調節(jié)具有明確的作用，但FK506對移植受體血糖水平的影響是否與SCFA有關仍不清楚。當糖尿病患者的胰島素分泌減少或產生胰島素抵抗時，機體糖利用率下降，而脂肪、蛋白利用率升高，可致體質量下降[18]。本研究報道了大鼠注射FK506后體質量、血糖水平以及體內SCFA含量的變化。我們發(fā)現(xiàn)大鼠服用FK506后，與對照組比較，F(xiàn)K506組大鼠的相對體質量顯著降低，血糖水平顯著升高，糞便中的SCFA顯著降低，提示FK506導致血糖水平的升高可能由糞便SCFA含量降低引起。而FK506組和對照組大鼠血液中SCFA含量則無顯著差異，可能與FK506主要影響腸道菌群相關。本研究仍有一定局限性。首先，糞便SCFA大部分由腸道菌群分解產生，研究未對大鼠各類腸道菌群進行觀察；其次，大鼠飲食及腸道菌群與人類的差異，以及臨床腎移植受體同時服用其他免疫抑制劑的偏倚，導致此研究結果不能直接轉化至臨床，仍需進一步的實驗加以驗證。綜上所述，F(xiàn)K506可導致大鼠血糖水平升高，這種升血糖的作用可能由大鼠糞便SCFA含量降低引起。

作者：黃中力；蔣亞梅；宋涂潤；王顯丁；范鈺；劉金鵬；王志靈；王莉；林濤