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《生物化學與生物物理進展雜志》2016年第二期

摘要

神經細胞的特化之一是其軸突，長度可達胞體直徑的幾百甚至幾千倍．軸漿轉運維系著胞體和軸突終末之間大量的物質交流，保證神經細胞發揮正常功能．軸漿轉運障礙可以導致神經細胞功能受損直至凋亡．在一些視神經疾病中，軸漿轉運功能的改變是最早出現的癥狀，因此也可能成為治療的潛在靶點．在青光眼和視神經缺血的動物模型中，軸漿轉運功能的下降是最早出現的變化之一．而Leber's遺傳性視神經病變(LHON)和常染色體顯性視神經萎縮(ADOA)是已知線粒體功能障礙引起的視神經疾病．不難想象，長距離軸漿轉運功能對能量代謝尤其敏感，因此在LHON和ADOA中可能也有不同程度的下降，但似乎并沒有受到足夠關注．本文首先回顧了微管和馬達蛋白在軸漿轉運中的作用，比較分析以上所述幾種疾病的發病機制、臨床表現及治療手段，試圖發現它們之間的共同特點以及這些特點與能量代謝、軸漿轉運之間的潛在關系，為其治療提供新的思路．

關鍵詞

視神經疾病，青光眼，Leber's遺傳性視神經病變，常染色體顯性視神經萎縮，能量代謝，軸漿轉運

神經元是一種極化細胞，即它具有樹突、胞體和軸突．細胞內的物質運輸是其進行生命活動的基本功能之一，而神經元軸突相對胞體極大的長度，對細胞器和蛋白質以及其他物質在細胞內的轉運形成了一定的挑戰．細胞內的物質運輸依賴微管和馬達蛋白．視網膜神經節細胞是視網膜的輸出元件，它的軸突組成視神經，在一些視覺系統疾病中，視神經軸漿轉運可能也會是易感環節．在青光眼中，有大量研究表明軸漿轉運功能障礙的出現遠早于視網膜神經節細胞的死亡．軸漿轉運是一個耗能的過程，對青光眼模型的研究表明，軸漿轉運障礙可能與線粒體功能受到各種影響而發生異常有關．這使我們聯想到Leber's遺傳性視神經病變和常染色體顯性視神經萎縮這兩種已明確的線粒體異常引起的視神經疾病中軸漿轉運可能也會發生異常．我們比較分析了這幾種疾病的病因、癥狀及治療方法，試圖發現提高能量代謝水平或重塑軸漿轉運功能的方法，為這些疾病的治療提供新思路．

1軸漿轉運

細胞內蛋白質和細胞器的運輸是進行生命活動的最基本功能之一，對神經元尤為重要．因為神經元擁有一個獨特的結構———軸突，其長度可達胞體直徑的幾千倍．很多蛋白質和細胞器需要從胞體運輸到軸突及其終末，而軸突終末從靶位置攝取的某些物質，也需要運輸到胞體發揮作用，有些甚至可以影響細胞存活．細胞的物質運輸系統由微管和馬達蛋白組成．微管是由13個原絲聚合形成的中空的管狀結構，每個原絲都是由結構相似的球蛋白α、β微管蛋白(α-，β-tubulin)異二聚體組合成的．其聚合和水解較快的一端被稱為正極，另一端則為負極．正極分布于細胞外周，負極則集中在細胞核附近的中心粒．由于微管蛋白結合的鳥苷酸可以有二磷酸或三磷酸的形式，所以微管蛋白在一定條件下會表現出動態不穩定(dynamicinstability)，即微管蛋白的一端會在延伸和縮短之間轉換．在神經細胞的軸突中，微管的排列方向與胞體內是一致的：正極朝向突觸終末而負極朝向胞體．微管是軸漿轉運的軌道，微管蛋白的翻譯后修飾能形成更為穩定的微管結構．Hammond等[1]認為微管的動力學特性主要是由微管蛋白的翻譯后修飾等引起．2010年，Janke和Kneussel[2]發現，在成熟穩定的軸突中富含乙酰化的α-tubulin，它們與微管的穩定相關．2012年，Cho等[3]也發現在外周神經系統中的軸突損傷處乙酰化的神經微管蛋白明顯減少．

與微管結合的馬達蛋白有2種：驅動蛋白(kinesins)家族和動力蛋白(dyneins)家族．驅動蛋白結構與肌球蛋白(myosinⅡ)相似，由2條重鏈和2條輕鏈組成．重鏈的頭部是球型馬達結構域，尾部由2條重鏈組成二聚體．驅動蛋白超家族擁有至少10個家族．大多數成員的馬達域在N端，向微管的正極運輸，而一些成員的馬達域在C端，向微管的負極運輸．驅動蛋白的運輸速度在2～3mm/s．動力蛋白家族則負責向微管的負極運輸．軸漿轉運中涉及的是胞漿動力蛋白(cytoplasmicdyneins)．它們通常是重鏈的同二聚體，有2個大的馬達域構成的頭部，運輸速度可達14mm/s．動力蛋白本身就是一個大的蛋白質復合體，在運送細胞器時，它們還需要和另一個大的復合體動力蛋白激活蛋白(dynactin)形成復合體．根據物質運輸的速度，軸漿轉運可分為快速運輸和慢速運輸．我們對軸漿轉運速度的認識多來自于經典的脈沖追蹤術，這種方法用于多種動物的在體研究，發現一部分被標記的蛋白(膜性細胞器和膜蛋白)運動速度較快，為50～200mm/d，細胞骨架蛋白如微管蛋白、神經纖維絲以及成百上千種可溶的或胞漿蛋白如代謝酶、熱休克蛋白、馬達蛋白等這些蛋白運動速度很慢，為0.2～10mm/d，其中微管蛋白和神經纖維絲速度最慢，為0.2～1mm/d．現普遍認為快速運輸是由驅動蛋白和動力蛋白負責的順向轉運和逆向轉運組成．慢速轉運多為順向運輸，也有極少的逆向轉運被報道．最經典的研究是Fink和Gainer[4-5]將軸突中間標記，之后觀察到慢速運輸向兩個方向進行．之后又有動力蛋白參與慢速運輸的相關報道[6-7]．一些研究表明，無論是快速運輸還是慢速運輸，都是由分子馬達參與的，之所以后者速度慢，是因為其在運動過程中存在長時間的停頓[8-9].當然，慢速運輸的機制比快速運輸復雜得多，而且可能不止上述一種[10]．

2視神經疾病及其與軸漿轉運障礙的可能關系

視網膜神經節細胞是視網膜的輸出元件，以動作電位編碼光刺激，通過其軸突，即視神經將其信號傳至更高級的視覺中樞．絕大部分的視神經投射至丘腦外側膝狀體，換元后投射至初級視皮層，為成像作貢獻．大部分的軸突亦有分支投射至中腦上丘，控制眼動．另有一些節細胞投射至下丘腦、中腦等一些核團，控制瞳孔反射、晝夜節律等非成像視覺功能．視神經病變，如青光眼、Leber's遺傳性視神經病變及常染色體視神經萎縮等，它們病程最終的結果都是視網膜神經節細胞退化從而致盲．

2．1青光眼青光眼是僅次于白內障的第二大致盲疾病．青光眼是由主要風險因子眼內壓的升高[11]或其他多因素導致的以視乳頭凹陷、視盤受損后周邊神經纖維層變薄、視網膜神經節細胞退行性病變、視功能進行性損害為主要特點的慢性進展性疾病．青光眼通常被分為開角型青光眼和閉角型青光眼兩類．前者起病時并無明顯癥狀，早期患者視力并無明顯損害，隨著疾病的逐漸發展，視盤周圍神經纖維進一步丟失，患者視野表現為進行性縮小，疾病終晚期患者視力喪失．閉角型青光眼則為急性發作，有眼壓增高及疼痛．少數患者表現為以視乳頭黃斑束最先損害的中心視野缺損．兩種類型青光眼最終均可致盲．青光眼病因復雜且尚無定論．轉基因動物DBA/2J小鼠中部分動物眼壓隨年齡上升，較好地模擬了人類開角型青光眼．2008年，Buckingham等[12]的研究表明：3月齡時小鼠眼壓上升；6月齡時，軸漿轉運熒光金的功能開始下降；12月齡時軸突斷裂；18月齡時細胞體固縮，凋亡．Dengler-Crish等[13]在2014年也在DBA/2J的小鼠模型中討論了軸漿順向運輸和逆向運輸障礙發生的關系問題，他們發現在9～10月齡的小鼠中，CTB標記的上丘面積的減少較熒光金標記的節細胞數量的減少更甚，表明軸漿順向運輸障礙要比逆向運輸障礙更為嚴重．在青光眼中，也有多項研究顯示與軸漿轉運相關的馬達蛋白確實出現異常．2006年，Martin等[14]采用了一個激光灼燒房水流出區域造成房水循環受阻的慢性青光眼大鼠模型，他們發現在眼壓升高3天后，視神經乳頭處72ku的動力蛋白中間鏈就發生積累．在急性高眼壓模型中，將眼壓升至較高水平時，熒光金標記的大鼠視神經軸漿的逆向轉運功能明顯下降[15]，而眼壓升至40～50mmHg時，大鼠逆向轉運功能先下降，不過在一周后又恢復至正常水平[16]．普遍認為青光眼中視神經乳頭是軸漿轉運最早發生障礙的部位[17-21]．2011年，Chidlow等[22]發現，在慢性激光灼燒小梁網的慢性青光眼模型中，視神經乳頭處蛋白的積累早在模型后8h就已發生，且在24h蛋白的積累達到頂峰．但近來也有研究顯示軸突遠端先受影響[23]．何士剛實驗室長期觀察了急性視網膜缺血模型后視網膜神經節細胞軸漿轉運功能，軸突連續性及視功能的變化，證實了軸漿轉運功能的下降早于軸突連續性的變化，并且軸漿轉運功能的下降與視銳度和反差靈敏度測試表征的視功能下降有很強的相關性．我們發現，一旦出現視功能障礙即進行治療，視功能便可基本恢復至正常狀態[15]．這些證據表明，早期的視功能下降，可能包括早期的視野缺失，并非完全是不可逆的．恢復了軸漿轉運，就有可能逆轉視功能的下降．有研究表明，青光眼的發生及視覺喪失與線粒體功能障礙有關[24-25]．眼內壓升高會使視網膜處于供血不足的狀態，導致線粒體功能受損[26]．視網膜神經節細胞中的線粒體作為獨立的部件，通過軸漿快速轉運，從胞體運輸至軸突末梢[27-28]．這個過程是由驅動蛋白和微管介導的，需要ATP的參與．在大鼠中，線粒體的生命周期一般為3周[29]．一旦能量代謝異常，會影響線粒體在節細胞中的運輸，進而造成惡性循環，更嚴重地影響能量代謝和軸漿轉運．2015年，Takihara等[30]發現：在4月齡的慢性青光眼模型小鼠上，節細胞死亡之前軸漿轉運線粒體的數量就已經減少，但線粒體的其他轉運指標，如持續時間、轉運距離和工作周期等均未發生變化；到23～25月齡時，轉運線粒體的時間、距離及工作周期均有下降．青光眼發病和進展隨年齡增長而增長，這可能也和線粒體隨著年齡的增長所出現的結構和功能的退化相關．比如氧化磷酸化能力減弱、活性氧的產生增加、線粒體DNA的突變增多等等．因為視神經中含有豐富的線粒體，對這些變化可能尤其敏感，而視神經的損害，進而會影響視覺功能[25]．最初治療青光眼的目標主要是降低眼內壓．使眼壓下降20%～40%能夠將視野缺失的速度減半[31-32].最早降眼壓的滴眼液于1875年問世，目前常用的降眼壓藥物主要為β受體阻斷劑、碳酸酐酶抑制劑、前列腺素類似物、α2腎上腺素受體激動劑、擬副交感神經藥物等．除了單一成分的滴眼液之外，也存在一些復合制劑．以上這些滴眼液可以減少房水的形成或增加其排出．不過由于青光眼病因不明，也可能是視神經軸漿轉運障礙造成的神經營養因子的運輸障礙[33]，以致視網膜神經節細胞缺乏神經營養因子(尤其是腦源性營養因子BDNF和神經生長因子NGF)而死亡[34-35]．例如，2000年Pease等[36]發現在急性高眼壓的猴子和大鼠的視神經乳頭處BDNF及其受體TrkB都有積累．因此，通過直接或基因治療方式在視網膜中施加神經營養因子，保護神經細胞及改善能量代謝和軸漿轉運功能[15,37-38]，可能也不失為治療青光眼的策略之一．

2．2常染色體顯性視神經萎縮(ADOA)常染色體顯性視神經萎縮(ADOA)也叫做Kjer's視神經萎縮，因丹麥的眼科醫生Kjer發現了19個ADOA家族而得名，其遺傳遵循孟德爾遺傳法則．隨后在英國、美國和法國又有大的家族被報道患有該病．引起ADOA的基因OPA1直到2000年才被發現[39-40]，是由染色體3q28的核DNA編碼，而該基因的蛋白質產物靶向線粒體發揮功能，其線粒體損傷致疾病的本質才完全被證明．ADOA在全世界的患病率達3/100000，在丹麥，它的發病率更是高達1/10000[41]．該病發病較早，在兒童時期就已發病．ADOA在發病初期沒有明顯癥狀，且多為雙側視神經病變．患者一般會經歷緩慢的疾病惡化過程———視力逐漸退化．在個別成人中也有視力急劇下降的報道．眼底檢查發現在視盤顳側有雙邊對稱的白色區域，說明匯聚至視神經軸突的神經纖維確實減少．ADOA視野的丟失從中央開始，ADOA患者還有視敏度下降、色覺受損等癥狀．有一小部分患者會有一些額外的臨床表現，如神經性耳聾、進行性眼外肌麻痹、共濟失調和肌肉病變等[42-43]，被稱為ADOA+．截至目前，已發現3個與ADOA相關的基因：OPA1、OPA3和OPA7，均編碼線粒體內膜上的蛋白．OPA1編碼的蛋白是動力蛋白相關的鳥苷三磷酸酶，該蛋白在線粒體融合和細胞色素C的釋放中發揮重要作用[44]，并作為一個關鍵蛋白在線粒體動力學網絡中發揮作用．線粒體的動力學是指線粒體沿細胞骨架的運動以及線粒體形態的變化，由融合和分裂控制，其正常進行能保證線粒體正確選擇形成管狀結構還是網狀網絡．OPA1基因編碼的蛋白能確保內膜的融合，它分布于膜間隙、內膜和線粒體的嵴上，另外，OPA1還能在興奮性毒性的環境下促進神經元的存活[45]．所以，ADOA是由核DNA突變引起的線粒體動力學障礙致使節細胞死亡視神經萎縮的疾病．2009年，White等[46]發現，在ADOA的小鼠模型中，6月齡的小鼠模型與正常小鼠在視神經軸突形態上并無明顯差異，9月齡的小鼠視神經開始出現變性，到24個月時，模型鼠視神經數量比正常小鼠明顯減少，此時節細胞層的自噬小體的數量也明顯增多．2010年，Heiduschka等[47]用熒光金逆行標記ADOA模型視網膜節細胞，發現20月齡的ADOA小鼠模型視網膜外周和中央節細胞的數量都明顯下降．熒光金標記的節細胞減少反映了ADOA模型視神經軸漿轉運的逆向運輸發生了障礙．但也有研究推測ADOA并非僅由線粒體一個原因所致，OPA1的另一個作用是與嵴相互聯系，從而在細胞凋亡中起作用[48]．ADOA的臨床表現與開角青光眼比較相似，在發病早期甚至會造成誤診．而開角青光眼患者OPA1基因的表達也可以出現異常[49]．有研究發現，在DBA/2J的慢性青光眼模型視神經乳頭處，線粒體融合、嵴的體積等都有異常，且在此處OPA1基因的表達也有所下降[50]．神經元的存活在一定程度上與由線粒體功能決定的能量供給直接相關．2012年，Park等[51]發現在大鼠的青光眼模型中存在自噬小體產生的現象．這些發現表明，ADOA中節細胞的死亡機制與青光眼模型有許多相似之處．對ADOA視神經軸漿轉運方面的研究還很少，如果在動物模型上對順向轉運和逆向轉運進行詳盡的研究，也可能為該疾病的治療提供線索．目前，ADOA還沒有有效的治療手段．在一個果蠅的ADOA模型中發現增加的活性氧能夠影響果蠅的病理學表型[52]，這使抗氧化治療成為可能的方案．因為ADOA是顯性遺傳，對患者的基因檢測及基因治療，理論上應該可以獲得滿意的療效，但目前尚未見到對ADOA基因治療的報道．而青光眼和ADOA相似的癥狀及神經節細胞相似的凋亡機制提示，神經保護及軸漿轉運的恢復，可能也不失為治療ADOA的策略．在凋亡誘導因子(AIF)基因突變的小鼠中，用AAV攜帶正常的AIF基因進行眼內注射，顯示基因治療后能夠減少視神經的萎縮[53]．AIF是核基因，其缺陷也影響到視網膜線粒體功能．所以這項研究，為用基因治療修復與線粒體功能相關的核基因治療視神經萎縮，為ADOA可能的干預提供技術路線．

2．3Leber’s遺傳性神經病變(LHON)150年前，第一例LHON由vonGraefe報道，而因TheodorLeber于1871年對其進行深入的臨床分析而得名．這種遺傳的視神經病變在任何一個年齡階段都會出現，但多數發生在20～40歲之間，且往往雙眼都患病．由于在男性青年中多發，一度被認為是伴X染色體遺傳．1988年，Wallace和他的同事們[54]發現了第一個LHON相關的線粒體基因的突變———ND4基因，一個編碼NADH脫氫酶的基因，此病才被證實是線粒體染色體發生突變的母系遺傳．隨后，其他的線粒體突變基因也被發現[55-56]．導致LHON最重要的原因是線粒體基因編碼涉及電子傳遞鏈復合體Ⅰ蛋白的突變．有研究表明，LHON中節細胞的死亡機制可能是細胞凋亡[57]，而離體研究表明這可能是由于ATP供給不足造成葡萄糖的合成困難而引起的[58]．復合體Ⅰ是活性氧的主要來源，LHON可能由于活性氧的增加導致節細胞凋亡．另有研究表明，已有突變的線粒體阻隔Ca2+的能力也有所下降，致使線粒體內Ca2+的濃度增加[59]．這些改變都可能導致神經節細胞的損傷甚至凋亡．LHON病人也會表現出視敏度下降、色覺障礙，嚴重時，視神經成杯狀并萎縮[26]，這可能是因為視神經的乳頭黃斑束處纖維更薄更容易受到破壞，也可能是由于能量代謝異常引起軸漿轉運功能下降而在視神經上表現出的相似癥狀．但是，目前似乎并沒有關于LHON中軸漿轉運功能是否或如何受到影響的報道．不過，線粒體功能障礙可能對軸漿轉運有重要影響也不是無端的推測．2000年，Sadun等[60]對兩例LHON患者的節細胞死亡及視神經減少的情況進行了分析，發現這兩例LHON患者的視神經軸突減少量從95%～99%不等，位于中央的較小直徑的軸突損傷最為嚴重，外圍直徑大的軸突相對比較完整．當然由于患者年齡、患病時間等因素的不同，不同LHON病人的視神經減少程度也不盡相同．關于治療LHON的探索一直在持續，但到目前為止還沒有十分有效的方法．常規的是化學藥物治療，主要研究有維生素和溴莫尼定．雖然維生素B12不能成功治療LHON，但它在由LHON維生素B12缺乏引起的視力喪失方面還是能夠發揮一定作用的[61-62]．溴莫尼定是一種腎上腺素α2受體激動劑，能夠通過上調Bcl-2減少節細胞的死亡[63-64]，但由于受試者招募數量和并未達到減輕視覺損傷的目的，該藥在臨床試驗階段即被終止[65]．另外還有一些抗氧化的藥物，如輔酶Q10和艾地苯醌．輔酶Q10是線粒體電子傳遞鏈的一個輔因子．但現在還沒有輔酶Q10治療LHON成功的案例，一個可能的原因是輔酶Q10從磷脂膜往線粒體的傳送存在障礙．艾地苯醌是輔酶Q10的衍生物，克服了上述輔酶Q10的缺點．2009年，Eng等[66]的研究顯示，7名接受艾地苯醌治療的LHON患者的視敏度、色覺及視野都有所恢復．LHON最根本的原因是線粒體基因ND4的突變．從目前的情況看，也許可以通過基因治療根治LHON．2012年Yu等[67]成功地將能夠表達線粒體ND4基因的AAV病毒載體注射至LHON小鼠眼中，發現在線粒體中ND4DNA的表達升至80%．Bainbridge等[68]發現，經過基因治療的患者視敏度在治療后6～12個月時恢復至最高水平，12個月之后又有所下降，但較未治療眼仍為明顯好轉．從上述討論可以看出，基因治療對LHON來講是從最根本致病機理出發的一種治療方法，也是效果最為顯著的一種方法．因為LHON是一個雙側眼均病變的視神經疾病，且發病時間有一定的差別，所以在確診后對未發病眼的干預，推測可以達到令人滿意的療效．不過，基因治療后可能的免疫反應會影響其實施，如何用最小劑量的載體病毒表達出最多的ND4蛋白[69]，也是一個亟待解決的問題．

3總結與展望

本文重點討論了青光眼、ADOA、LHON三種疾病的癥狀和病因，希望闡釋能量代謝和軸漿轉運功能障礙對這幾種疾病產生的相似影響，提示改善能量代謝和軸漿轉運功能，可能成為治療這幾種疾病的共同策略．我們現將上述討論內容中三者的不同之處總結于表1。青光眼的致病因素比較復雜，不過在慢性和急性眼內壓升高的動物模型中，都觀察到在神經節細胞受損之前，較早出現的是軸漿轉運功能障礙，進而是軸突斷裂和細胞凋亡．可能的機制之一是眼內壓升高后，視網膜的血供受到影響，從而影響了能量代謝及軸漿轉運．相比之下，ADOA的病因非常明確，是由于線粒體相關的核基因突變造成線粒體功能障礙，即能量代謝障礙引起的．其諸多與青光眼相似的癥狀，被誤診為青光眼的可能，以及少量軸漿轉運受損的報道，這些事實在一定程度上說明了2個問題：a．雖然青光眼病因復雜，但可能匯聚的最終通路是能量代謝異常引起的軸漿轉運障礙，進而引起神經節細胞凋亡和視功能喪失；b．ADOA的發病早期，可能也存在著軸漿轉運的障礙．再對比LHON，病因也非常清晰：線粒體基因的突變引起能量代謝異常．其病情的劇烈惡化，提示線粒體ND4基因與ADOA涉及的OPA1等基因相比，在能量代謝中的作用更為重要，也無法補償或替代．一旦ND4出現問題并嚴重到一定程度，節細胞和視功能就會出現災難性的損害．但少數LHON病人的視功能在一定時間后能有所恢復，也表明至少在這些病人上，視功能的喪失并非不可逆的．對照何士剛實驗室在急性眼內壓升高模型上的發現，軸漿轉運功能和視功能有較高的相關性，而軸漿轉運障礙遠早于軸突斷裂，所以只要在不可逆的損傷出現之前，采取措施維持或恢復軸漿轉運功能，就能維持和恢復視功能．而那些視功能有所恢復的LHON患者，可能就是因為其節細胞的能量代謝和軸漿轉運功能，尚未進入不可逆的區間，在后期有所穩定和恢復．我們希望通過本文對三種疾病的比較和討論，提示能量代謝與軸漿轉運在這幾種疾病中相似的重要作用，從而聚焦改善能量代謝和軸漿轉運功能作為治療這些疾病的共同策略的討論．

作者：王江華 田國紅 何士剛 單位：上海交通大學生物醫學工程學院 復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院