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《生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展雜志》2016年第二期

摘要

熒光膜片鉗(patch-clampfluorometry，PCF)是將離子通道蛋白局部的構(gòu)象變化和門控緊密結(jié)合，實(shí)時(shí)記錄同一膜片上離子通道的熒光和電流信號(hào)的創(chuàng)新型生物物理學(xué)技術(shù)，其特點(diǎn)是將經(jīng)典的膜片鉗和現(xiàn)代光學(xué)記錄結(jié)合起來(lái)，實(shí)時(shí)同步完美呈現(xiàn)離子通道執(zhí)行其功能時(shí)的蛋白質(zhì)構(gòu)象信息．與研究結(jié)構(gòu)的X射線和冰凍電鏡不同，熒光膜片鉗提供離子通道處于真實(shí)細(xì)胞膜生理環(huán)境并執(zhí)行功能的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)信息．隨著新的光學(xué)技術(shù)、顯微成像技術(shù)、圖像分析技術(shù)等的進(jìn)步，大大地?cái)U(kuò)展了熒光膜片鉗技術(shù)的記錄范圍、分辨精度及敏感度，使研究者以前所未有的時(shí)空分辨率來(lái)實(shí)時(shí)觀察和記錄離子通道蛋白的結(jié)構(gòu)變化．

關(guān)鍵詞

熒光膜片鉗，熒光分子，蛋白質(zhì)構(gòu)象，膜蛋白，門控

離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一類復(fù)雜的細(xì)胞膜蛋白，其存在使得細(xì)胞-細(xì)胞間以及細(xì)胞-環(huán)境間離子交換及相關(guān)的信息交流成為可能，其功能的執(zhí)行同蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化息息相關(guān)．離子通道的開放和關(guān)閉的過(guò)程稱為門控，離子通道門控的過(guò)程是以蛋白質(zhì)構(gòu)象重排的形式實(shí)現(xiàn)的，精確地觀察解析構(gòu)象變化及其在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用是揭示通道蛋白功能的分子機(jī)制的關(guān)鍵．長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)離子通道門控的研究通常采用膜片鉗這個(gè)“金標(biāo)準(zhǔn)”技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)．隨著對(duì)離子通道研究的深入，簡(jiǎn)單地記錄離子電流顯示出了它的局限．首先，離子電流反映的是通道在開放狀態(tài)下的功能指標(biāo)，它無(wú)法直接反映通道蛋白在門控的過(guò)程中結(jié)構(gòu)變化的特性；其次，由于離子電流僅存在于開放狀態(tài)，在多重關(guān)閉狀態(tài)以及過(guò)渡狀態(tài)的信息是缺失的．熒光膜片鉗(patch-clampfluorometry，PCF)[1-4]是用來(lái)研究這些缺失的信息的一種新的實(shí)驗(yàn)技術(shù)．熒光膜片鉗借助特異位點(diǎn)熒光記錄使在細(xì)胞膜環(huán)境下直接實(shí)時(shí)觀察蛋白質(zhì)分子活動(dòng)成為可能，實(shí)現(xiàn)同時(shí)記錄細(xì)胞膜片上的離子通道蛋白的局部結(jié)構(gòu)變化和功能狀態(tài)．為了獲取各種與功能相對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)構(gòu)象信息，熒光膜片鉗利用小熒光分子作為定位探針，熒光團(tuán)被嵌入到通道蛋白或通道配體分子的特異位點(diǎn)(圖1)，研究者可同時(shí)記錄特異位點(diǎn)的實(shí)時(shí)熒光和電流[5-6]．熒光膜片鉗技術(shù)的應(yīng)用為膜蛋白及相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、膜受體蛋白結(jié)構(gòu)功能的關(guān)系研究提供了一個(gè)全新的工具．

1熒光電壓鉗技術(shù)

在過(guò)去的幾十年里，電生理技術(shù)的應(yīng)用使離子通道的功能和調(diào)控被廣泛研究，通道蛋白的詳細(xì)結(jié)構(gòu)信息則采用X射線和冰凍電鏡的方法獲得，特別是冰凍電鏡技術(shù)的使用，在近兩年提供了大量存在于膜環(huán)境中的通道蛋白的結(jié)構(gòu)信息．然而，這些方法要么單純跟蹤功能變化，要么只顯示蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，沒(méi)有一種方法可以直接將離子通道的構(gòu)象變化和功能狀態(tài)結(jié)合起來(lái)．為了克服這一缺陷，不同的光譜技術(shù)被嘗試著與經(jīng)典的電生理學(xué)方法結(jié)合，將同時(shí)檢測(cè)通道功能和構(gòu)象變化直接聯(lián)系起來(lái)．20世紀(jì)90年代，Dr.Isacoff等[7]建立了熒光電壓鉗(voltage-clampfluorometry，VCF)技術(shù)，研究鉀離子通道蛋白的電壓敏感域在電壓激活過(guò)程中的運(yùn)動(dòng)．最初熒光電壓鉗用來(lái)記錄爪蟾卵母細(xì)胞全細(xì)胞模式下的功能性離子通道．在實(shí)驗(yàn)前幾天，編碼包含半胱氨酸離子通道蛋白的mRNA通過(guò)顯微注射，表達(dá)于非洲爪蟾卵母細(xì)胞，隨后將卵母細(xì)胞浸入包含可與半胱氨酸反應(yīng)的熒光團(tuán)的溶液中，在卵母細(xì)胞胞外暴露的半胱氨酸殘基即可與熒光團(tuán)分子通過(guò)形成共價(jià)鍵被熒光標(biāo)定．通常選取卵母細(xì)胞富含色素且胞體組分中產(chǎn)生的自發(fā)熒光較少的動(dòng)物極進(jìn)行熒光記錄．實(shí)驗(yàn)中電壓鉗記錄電壓敏感離子通道的激活及檢測(cè)通道的功能狀態(tài)，熒光變化直接記錄暴露于細(xì)胞外側(cè)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的實(shí)時(shí)運(yùn)動(dòng)，其開發(fā)者將這一技術(shù)命名為熒光電壓鉗(VCF)．隨著該項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展，結(jié)合熒光電壓鉗和熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescenceresonanceenergytransfer，F(xiàn)RET)技術(shù)，研究人員證明了電壓敏感鉀通道的第四跨膜域在電壓門控通道的激活過(guò)程中經(jīng)歷了原子水平分辨率的轉(zhuǎn)動(dòng)和可能的平移運(yùn)動(dòng)[7-9]．同時(shí)熒光電壓鉗也被應(yīng)用到不同家族的離子通道及膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、受體蛋白的研究[10-17]．然而，研究者發(fā)現(xiàn)熒光電壓鉗受其電壓鉗制模式和敏感性的限制，無(wú)法解決對(duì)于離子通道胞內(nèi)部分的結(jié)構(gòu)變化問(wèn)題．

2熒光膜片鉗技術(shù)

2．1熒光膜片鉗技術(shù)及其應(yīng)用2000年，受熒光電壓鉗的啟發(fā)，Zheng與Zagotta[1]共同努力，一種新的結(jié)合熒光記錄和內(nèi)面向外膜片鉗模式的熒光膜片鉗(PCF)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，該技術(shù)最初設(shè)計(jì)解決環(huán)核苷酸門控(CNG)通道蛋白與cGMP結(jié)合所產(chǎn)生的化學(xué)能如何驅(qū)動(dòng)通道被激活的問(wèn)題．首次報(bào)道的熒光膜片鉗研究中，將馬來(lái)酰亞胺用Alexa488熒光標(biāo)記后，觀察其修飾CNG通道蛋白上的半胱氨酸(胞內(nèi)C端環(huán)核苷酸結(jié)合域的C481位點(diǎn))的作用，通過(guò)記錄熒光信號(hào)判斷修飾所引發(fā)的通道蛋白結(jié)構(gòu)變化，從而影響cGMP與CNG通道蛋白結(jié)合以及通道的激活．實(shí)驗(yàn)時(shí)，采用一根開口大約為幾微米的拋光玻璃電極，封接表達(dá)于包含半胱氨酸的離子通道蛋白的細(xì)胞膜表面，通過(guò)拉回玻璃電極使細(xì)胞表面撕下的一小塊細(xì)胞膜附著于玻璃電極尖部，熒光團(tuán)標(biāo)記和記錄都在這一平方微米尺度的細(xì)胞膜片上進(jìn)行．熒光膜片鉗允許在通道蛋白的胞內(nèi)及胞外兩側(cè)記錄熒光信號(hào)．由于熒光信號(hào)記錄的是從一小片游離膜上包含的離子通道信息，由胞內(nèi)組分所產(chǎn)生的自發(fā)熒光造成的污染被除去．這使得熒光信號(hào)的信噪比增加，從而得到更高的分辨率．當(dāng)結(jié)合高度敏感性、低噪聲的熒光探測(cè)器，熒光膜片鉗可以記錄到單獨(dú)一個(gè)蛋白質(zhì)分子，實(shí)現(xiàn)單分子實(shí)時(shí)記錄．基于內(nèi)面向外的熒光膜片鉗被稱為經(jīng)典熒光膜片鉗，而后不同的研究小組也陸續(xù)報(bào)道了全細(xì)胞模式、細(xì)胞貼附模式的熒光膜片鉗，作為熒光膜片鉗技術(shù)的擴(kuò)展．Yang等[6]將熒光膜片鉗技術(shù)應(yīng)用到HEK全細(xì)胞模式下溫度敏感TRP離子通道的溫度激活的實(shí)驗(yàn)研究中，采用全細(xì)胞模式，同時(shí)記錄通道電流和熒光信號(hào)，使得熒光膜片鉗最初的大部分優(yōu)勢(shì)得以保留，在電流發(fā)生階段，全細(xì)胞熒光膜片鉗只記錄胞外標(biāo)定的熒光團(tuán)．到目前為止，熒光膜片鉗被應(yīng)用于CNG通道門控及構(gòu)象變化關(guān)系[1,18]、CNG通道蛋白亞基配比[19]、HCN通道在超極化激活下配體結(jié)合和門控間的關(guān)系研究[20-23]．Mony等[24]應(yīng)用熒光膜片鉗結(jié)合熒光電壓鉗，對(duì)質(zhì)子通道Hv1的門控研究揭示了通道激活過(guò)程中S1和S4的結(jié)構(gòu)重排，指出兩部分在通道活動(dòng)中既相互獨(dú)立又相互影響的特性．最近Nomura等[25]將熒光膜片鉗技術(shù)應(yīng)用于細(xì)菌源的機(jī)械刺激敏感通道在人工構(gòu)建的脂質(zhì)膜中重組的方向特性研究．毫無(wú)疑問(wèn)，膜片鉗的多種鉗制模式使開發(fā)熒光膜片鉗新方法具有了許多優(yōu)勢(shì)．

2．2熒光膜片鉗技術(shù)優(yōu)勢(shì)熒光膜片鉗技術(shù)對(duì)胞膜上離子通道的特異位點(diǎn)采用熒光標(biāo)記，研究者可以直接觀察發(fā)生在特定通道結(jié)構(gòu)上的實(shí)時(shí)構(gòu)象重排．半胱氨酸通過(guò)基因突變技術(shù)被引入到通道蛋白的興趣位點(diǎn)，如果必要，通道蛋白上原有的半胱氨酸可以通過(guò)基因突變被全部替換以確保所有記錄信號(hào)的特異性．半胱氨酸殘基作為與巰基特異反應(yīng)的熒光團(tuán)的定位點(diǎn)，允許特異位點(diǎn)熒光團(tuán)標(biāo)定．電流和熒光信號(hào)被同時(shí)從同一組離子通道蛋白記錄，這是熒光膜片鉗與熒光電壓鉗的主要區(qū)別之一．電流信號(hào)，作為通道開放和離子流動(dòng)的結(jié)果，可做為通道功能的指示器．當(dāng)半胱氨酸附近的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)重排影響到熒光團(tuán)的量子產(chǎn)出、遷移率、與鄰近的熒光團(tuán)的距離變化等因素時(shí)，熒光發(fā)射也發(fā)生改變．這樣，熒光團(tuán)可作為蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的高度敏感的報(bào)告基團(tuán)．因?yàn)闊晒庑盘?hào)不像離子電流信號(hào)那樣依賴于離子通道孔區(qū)的開放，熒光記錄為探究離子通道蛋白到達(dá)開放狀態(tài)前的構(gòu)象變化的時(shí)空信息提供了一個(gè)新的手段．熒光膜片鉗作為一種全新的研究正常功能下通道蛋白分子活動(dòng)的方法，可以廣泛應(yīng)用于任何通道類型，甚至可以嘗試非通道的膜蛋白，如轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、受體蛋白等．研究也表明，熒光記錄也可以成為高通量藥物篩選中電流記錄的有效替代[26]．與直徑1mm的卵母細(xì)胞相比，分離的膜片要小得多．那么為什么還能得到足夠強(qiáng)的熒光信號(hào)呢？這其中的原因主要有兩個(gè)．第一，在HEK細(xì)胞膜上可以高密度地表達(dá)通道蛋白，對(duì)許多離子通道而言，從一片分離的細(xì)胞膜上可以得到幾百到幾千個(gè)通道分子，因?yàn)槊舾械墓鈱W(xué)探測(cè)器(如CCD相機(jī))可以觀察單個(gè)熒光分子，成百上千個(gè)熒光分子所發(fā)出的熒光在檢測(cè)上自然沒(méi)有問(wèn)題．第二，因?yàn)槟て苄。@樣就可以使用高采光效率的光學(xué)鏡頭(如40倍數(shù)值孔徑NA值大于1.4的高分辨物鏡)采集整個(gè)膜片上所有的熒光信號(hào)．與之相比，卵母細(xì)胞雖然很大，但大多數(shù)熒光都沒(méi)有被收集到．熒光膜片鉗記錄提供了優(yōu)越的敏感性和時(shí)間分辨率，而且同熒光電壓鉗記錄相比(圖2)，熒光膜片鉗可以直接控制胞內(nèi)環(huán)境，優(yōu)勢(shì)如下：第一，可以面對(duì)離子通道胞內(nèi)一側(cè)并對(duì)相關(guān)區(qū)域進(jìn)行標(biāo)定；第二，排除了由胞內(nèi)環(huán)境所造成的自發(fā)熒光，熒光探測(cè)敏感性大為提高；第三，可以施加胞內(nèi)配體及通道調(diào)節(jié)分子來(lái)調(diào)節(jié)通道的門控；第四，電流記錄具有更高的時(shí)間分辨率[1,27]．熒光膜片鉗利用小的熒光分子作為定位分子探針，這些熒光團(tuán)被嵌入到通道蛋白或通道配體分子的特異位點(diǎn)，熒光發(fā)射過(guò)程對(duì)熒光團(tuán)周圍環(huán)境變化具有高度的敏感性，如疏水性、電荷或是偶極、空間制約等等，在熒光團(tuán)附近的通道蛋白構(gòu)象重組影響這些參數(shù)會(huì)改變其熒光發(fā)射，這種變化可以從記錄到的熒光強(qiáng)度、顏色、各向異性等指標(biāo)的變化中反映出來(lái)．該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于其將通道功能狀態(tài)與通道結(jié)構(gòu)變化完美關(guān)聯(lián)起來(lái)[1,5-6,27]．

2．3熒光膜片鉗結(jié)合FRET技術(shù)的應(yīng)用隨著熒光膜片鉗技術(shù)的發(fā)展，熒光膜片鉗結(jié)合熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)等技術(shù)使研究者獲得了更多的關(guān)于結(jié)構(gòu)變化的細(xì)節(jié)部分．FRET是被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、域-域相互作用及構(gòu)象重排的有力工具．結(jié)合FRET技術(shù)監(jiān)測(cè)通道構(gòu)象變化時(shí)，通道蛋白兩個(gè)或更多位點(diǎn)被供體和受體熒光團(tuán)同時(shí)標(biāo)記，熒光共振能量轉(zhuǎn)移發(fā)生．FRET可以敏感地探測(cè)微小距離的變化，使其成為離子通道研究的有力工具[28]．Miranda等[29]應(yīng)用熒光膜片鉗并結(jié)合FRET技術(shù)檢測(cè)BK(大電導(dǎo)、電壓及鈣離子依賴的鉀通道)通道蛋白構(gòu)象重排，觀察到了鈣離子的結(jié)合誘發(fā)通道門控環(huán)區(qū)域的蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化，較之于應(yīng)用X射線測(cè)定離體蛋白的晶體結(jié)構(gòu)后所預(yù)測(cè)的構(gòu)象變化幅度要大得多．應(yīng)用FRET，Yang等觀察到TRPV1外孔區(qū)在熱激活過(guò)程的結(jié)構(gòu)變化：通過(guò)采用熒光素-馬來(lái)酰亞胺(FM)和四甲基羅丹明-馬來(lái)酰亞胺(TMRM)熒光標(biāo)記位于溫度敏感TRPV1通道蛋白孔區(qū)的兩個(gè)半胱氨酸測(cè)定其FRET效率的變化，從而確定溫度激活過(guò)程引起孔區(qū)結(jié)構(gòu)變化從而使通道開放[5-6]．新的小分子熒光團(tuán)及過(guò)渡金屬離子的引入使得熒光檢測(cè)的范圍更廣、靈敏度更高．利用過(guò)渡金屬與小分子熒光團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)移(tmFRET)，可以更加準(zhǔn)確地記錄蛋白局部的微小結(jié)構(gòu)變化．新的超敏感光學(xué)探測(cè)器如電荷耦合(CCD)相機(jī)為熒光膜片鉗技術(shù)的更新提供了便利基礎(chǔ)，而光譜儀(spectrograph)的引入極大地提高了熒光信號(hào)的分辨、分離及信息提取能力．

3結(jié)語(yǔ)

熒光膜片鉗技術(shù)是膜片鉗技術(shù)和光學(xué)記錄完美結(jié)合的一項(xiàng)創(chuàng)新型生物物理學(xué)技術(shù)，該技術(shù)利用蛋白質(zhì)巰基可被氧化修飾的特點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)離子通道蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，從而達(dá)到同時(shí)記錄在同一膜片上的同一(組)離子通道的熒光信號(hào)和電流信號(hào)．這一技術(shù)可以應(yīng)用于研究離子通道的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系，也可應(yīng)用于膜蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、受體蛋白等的動(dòng)力學(xué)研究，甚至可以作為高通量藥物篩選的有效手段．但是，目前世界范圍內(nèi)能夠成功應(yīng)用此技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室仍然很少．無(wú)論是膜片鉗操作，還是熒光標(biāo)記對(duì)于實(shí)踐者的技能操作要求都非常高，這也是目前為止阻礙這項(xiàng)技術(shù)得以推廣的主要挑戰(zhàn)．同時(shí)將熒光標(biāo)記擴(kuò)展到如熒光蛋白、小分子熒光團(tuán)等更廣范圍，將使研究者有更多的選擇．只有這些問(wèn)題都得到解決，伴隨著光學(xué)技術(shù)、成像技術(shù)的創(chuàng)新發(fā)展，熒光膜片鉗技術(shù)將會(huì)為研究者提供洞悉蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的更進(jìn)一步的微觀細(xì)節(jié)，而不斷更新的熒光膜片鉗技術(shù)必將為生命科學(xué)研究領(lǐng)域帶來(lái)新的曙光．

作者：程為 李玫 杜莎 鄭稢 單位：大連醫(yī)科大學(xué)腫瘤干細(xì)胞研究院