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《現代食品科技雜志》2014年第七期

1材料與方法

1.1原料南美白對蝦（PenaeusvannameiBoone）的蝦頭蝦殼，由陽江市海達速凍水產有限公司提供，凍存于-20℃備用。

1.2研究方法

1.2.1蝦油發酵將蝦頭蝦殼絞碎，加入原料重的5%的食鹽混勻，于45℃水浴中自溶（以80r/min震蕩）。4h后用紗布過濾得自溶液，測定自溶液的鹽度，并補充食鹽，分別將自溶液鹽度調節至16%、20%和24%。于35℃保溫發酵，定期測定各項指標，測定前補加蒸發掉的水分使鹽度保持恒定。

1.2.2理化指標測定pH值：以PB-10pH計測定；酸度：參照GB5413.34-2010，采用NaOH滴定法，當滴定至pH為8.3時，計算產品酸度；可溶性固形物：以BK8280糖度計測定，無鹽可溶性固形物含量為蝦油離心后所測得的可溶性固形物糖度減去產品相應鹽度產生的糖度；氨基酸態氮（AAN）：參照GB18186-2000中的甲醛滴定法測定。揮發性鹽基氮（TVB-N）和三甲胺（TMA）：采用康微皿法測定[11]。

1.2.3菌落總數按GB/T4789.2-2003方法稍作改進，耐鹽細菌和不耐鹽細菌分別用含10%鹽度和0%鹽度的PCA培養基計數。耐鹽真菌和不耐鹽真菌分別用含10%鹽度和0%鹽度的PDA培養基計數。

1.2.4蛋白酶活力的測定參照SB/T10317-1999的方法測定。在40℃下10min水解酪蛋白產生1μg酪氨酸定義為1個活力單位（U）。

1.2.5蛋白酶酶譜電泳樣品處理：取15mL蝦油，8000r/min離心10min，上清轉移至截留分子量為14000Da的透析袋中透析6h。透析完畢后用分子量為20000Da的聚乙二醇覆蓋在透析袋外面吸水至透析液體積到1~2mL，將透析液全部轉移至2mL離心管中，并用雙蒸水定容至2mL。非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（NativePAGE）和蛋白質轉移：制作電泳膠（分離膠10%，濃縮膠5%），使上述預處理的樣品在預冷藏的NativePAGE緩沖液（pH8.3Tris-Gly）中電泳以防因電壓過高導致蛋白質變性。調節濃縮膠電壓為80V，分離膠電壓為100V。電泳完畢后剝膠。提前制作好含0.25%酪蛋白的蛋白酶檢測膠（30%凝膠儲液2mL，2.5%的酪蛋白1mL，0.05mol/LTris-HCl（pH8.8）2.5mL，ddH2O4.5mL，TEMED10μL，10%AP100μL）。依次在半干轉電轉移裝置的負極板上鋪上濾紙，電泳膠，檢測膠，再鋪上濾紙，并驅除氣泡，蓋上正極板，以40mA電流轉移40min，取出檢測膠，于37℃孵育40min，以使酪蛋白充分水解。然后以考馬斯亮藍染色30min后于搖床上震蕩脫色過夜。檢測膠上的透明條帶即為蛋白酶水解帶。

1.2.6游離氨基酸的測定參照GB/T5009.124-2003的方法，采用日立-8800型氨基酸自動分析儀檢測。色譜柱：日立855-350型；反應柱溫：134℃；檢測波長：570nm和440nm；流速：0.35mL/min。標準氨基酸為Sigma產品。

1.2.7感官評定方法與標準采用定量描述分析法（QDA）進行感官評定。5個人為一小組，分四個小組，分別對樣品的顏色、奶酪味、肉味、氨味、醬香味、腥味、腐臭味進行評價。感官評定成員進行兩周，總時間不小于2h的培訓。

1.3數據分析所有理化指標進行三次平行測定，采用SPSSStatistics19軟件對數據進行單因素方差分析，數據表達成平均值±標準方差。p<0.05認為具有顯著差異。

2結果與討論

2.1鹽度對蝦油無鹽可溶性固形物和AAN的影響圖1中，16%鹽度的蝦油在發酵第10d已明顯腐敗，所以未繼續測定各項指標。其他鹽度發酵的蝦油在發酵初期20d內無鹽可溶性固形物及AAN含量迅速上升，后期相對平穩。無鹽可溶性固形物為蝦油離心后所測得的糖度減去蝦油所含食鹽所產生的糖度，可反映蝦油可溶性蛋白的趨勢。鹽度越高，無鹽可溶性固形物和AAN含量越小，這表明高鹽度會抑制蛋白酶活力，使可溶性蛋白或多肽的生成減少，從而導致游離氨基酸減少。經SPSS軟件方差分析可知，鹽度對樣品的無鹽可溶性固形物和AAN含量影響非常顯著（p<0.01）。

2.2鹽度對蝦油pH和酸度的影響圖2顯示，蝦頭蝦殼自溶液pH在8.0左右，隨著發酵的進行，蝦油pH逐漸減小，酸度緩慢增加，發酵30d后蝦油pH和酸度逐漸穩定在7.5~8.0范圍內，且鹽度越大，pH及酸度變化幅度越小，推測上述變化與蛋白質水解產生游離氨基酸和肽有關。經SPSS軟件方差分析可知，鹽度對樣品pH和酸度影響顯著（p<0.05）。

2.3鹽度對蝦油TVB-N和TMA的影響圖3顯示，蝦油的TVB-N和TMA的含量隨發酵時間的變化相似，在發酵前期20d內快速增加，以后漸趨平穩；且鹽度越高TVB-N和TMA的含量越低，16%鹽度的蝦油發酵至第10d時，TVB-N和TMA含量已分別劇增至0.61mg/mL和0.09mg/mL，而20%和24%鹽度的蝦油TVB-N和TMA含量一直分別保持在0.45mg/mL和0.04mg/mL以下。TVB-N和TMA分別由細菌等微生物分解氨基酸、氧化三甲胺等物質產生，鹽度越高對細菌等微生物的抑制作用越強；同時圖1顯示高鹽度時游離氨基酸的生成減少，細菌分解的底物減少，這些原因都會導致TVB-N和TMA含量降低。經SPSS軟件方差分析可知，鹽度對蝦油TVB-N和TMA含量影響非常顯著（p<0.01）。

2.4鹽度對蝦油中微生物的影響圖4顯示，發酵初期10d內耐鹽細菌的數量小于不耐鹽細菌，10d后耐鹽細菌快速增加，超過不耐鹽細菌成為優勢菌。還可發現20%鹽度的蝦油中耐鹽細菌的數量遠高于24%鹽度的蝦油。經SPSS軟件方差分析可知，鹽度對蝦油的耐鹽細菌和不耐鹽細菌的數量影響非常顯著（p<0.01）。表1顯示，蝦頭蝦殼自溶液中耐鹽和不耐鹽真菌都很少，約103cfu/mL，在發酵過程中，真菌的數量降至30cfu/mL以下，在很多樣品中甚至檢測不到。這說明在蝦油發酵過程中真菌幾乎不起作用。黃紫燕等[12]研究發現魚露的中嗜鹽酵母菌為優勢菌，這與本研究的結果不同，推測這種差異與原料差異有關，因魚露發酵過程中pH一般保持在4.5~6.0；而本研究的蝦油在發酵過程中pH一直在7.5~8.0范圍內，一般來說，略偏酸性的環境有利于真菌的生長繁殖。

2.5鹽度對蝦油蛋白酶活力和組成的影響圖5鹽度對蝦油蛋白酶活力的影響Fig.5Influenceofsalinityonproteaseactivityduringfermentationofshrimpsauce蝦油總蛋白酶包括蝦油內源蛋白酶和微生物產的外源蛋白酶。發酵10d內，總蛋白酶活力下降，10d后總蛋白酶活力上升，在發酵30d后趨于平衡。這種變化與圖4中細菌數量的變化趨勢相似，推測是發酵初期10d內，蝦油中部分內源蛋白酶在高鹽度下逐漸失活，同時細菌數量很少且呈下降趨勢，導致的發酵10d內總蛋白酶活力呈現下降趨勢。10d后細菌數量明顯增加，產生了新的蛋白酶，使總蛋白酶活力明顯上升。圖5顯示鹽度越高蛋白酶活力越低，說明高鹽度會抑制蛋白酶活力，Klomklao等[13]對魚露的研究也得出相似結論。經SPSS軟件方差分析可知，鹽度對蛋白酶活力影響非常顯著（p<0.01）。圖6是各種鹽度發酵的蝦油在不同時期的蛋白酶電泳圖譜，從譜帶亮度可知蛋白酶活力大小為20%鹽度>24%鹽度，這與圖5中蛋白酶活力測定的結果一致。蝦油內源蛋白酶（蝦頭蝦殼自溶液中的蛋白酶）有4種（1、2、3和4號），2、3、4號蛋白酶活力逐漸減小，只有1號蛋白酶活力沒有明顯下降，這也解釋了圖5中，蝦油在發酵10d內蛋白酶活力逐漸減小的現象。隨著發酵時間延長，蝦油中逐漸出現了自溶液中原本沒有的蛋白酶，發酵第5d時產生了新的蛋白酶（5、6、7、8號），第60d出現了新的蛋白酶（9和10號），這說明發酵過程中的微生物產生了蛋白酶。由于表2顯示真菌幾乎不起作用，所以新的蛋白酶很可能是圖4顯示的，發酵10d后迅速增加的耐鹽細菌產生的。綜上可知，蝦油發酵過程中內源蛋白酶和細菌蛋白酶交替作用，細菌蛋白酶對發酵的貢獻不可忽視。

2.6鹽度對蝦油游離氨基酸組成的影響由表2知，蝦油游離氨基酸種類豐富，尤其富含天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和精氨酸等甜味和鮮味氨基酸。20%鹽度和24%鹽度的蝦油甜味，甜味，鮮味和苦味氨基酸所占比例相當。但20%鹽度的蝦油中鳥氨酸、氨基乙醇、胱硫醚和氨等臭味和氨味等物質占比均高于24%鹽度的蝦油，且圖3顯示20%的蝦油TVB-N和TMA含量也高于24%鹽度放入蝦油，這說明20%鹽度時尚有微弱的腐敗作用發生，導致蝦油中產生一些不良風味成分。

2.7鹽度對蝦油感官評定的影響由表3的感官評定知，16%鹽度不能有效抑制腐敗，因此不適合發酵蝦油；20%以上鹽度才能有效抑制腐敗。20%鹽度發酵90d的蝦油醬香味和奶酪味較淡，夾雜著腥臭味和較濃的氨味；24%鹽度發酵的蝦油香氣濃郁，醬香味突出，肉味和鮮味明顯，酸臭味和腥味等不良風味較淡，且表2顯示的其鮮味，甜味和苦味呈味氨基酸比例協調，綜合風味較20%鹽度蝦油好。

3結論

本論文研究表明，蝦油發酵的鹽度需達到20%以上，否則將發生腐敗，但鹽度越高蛋白酶活力降低明顯，游離氨基酸的生成速度降低，綜合考慮防腐、風味形成等因素，24%鹽度是發酵蝦油的最佳鹽度。蝦油發酵過程中內源蛋白酶活力逐漸降低，細菌蛋白酶活力逐漸增加，并發揮重要作用；真菌對蝦油的發酵基本不起作用。

作者：段杉胡小喜廖廣強吳永和鄺浩斌楊柳李婷周幸芝單位：華南農業大學食品學院