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《現代食品科技雜志》2014年第七期

1材料與方法

1.1材料與試劑試驗材料：黃曲霉菌CGMCC3.2890，購于中國普通微生物菌種保藏管理中心，PDA培養基4℃保存。試劑：黃曲霉毒素B1（aflatoxinB1，AFB1），購于sigma公司；總茶多酚（TP）、槲皮素（quercetin）、沒食子酸（gallicacid）、兒茶素（catechin）及其衍生物包括（-）-沒食子兒茶素（GC）、（-）-表沒食子兒茶素（EGC）、（-）-表兒茶素（EC）、（-）-表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、（-）-表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、(-)-兒茶素沒食子酸酯（CG）、（-）-沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG），均購自NacalaiTesqueInc.（Kyoto，Japan），純度大于98%；活性氧熒光探針Carboxy-H2DCFDA（Eugene，OR）、愈創木酚、三氯乙酸、TBA、TCA、槲皮素、過硫酸銨、SDS、ß-巰基乙醇、聯苯、抗壞血酸、四甲基乙二胺、核黃素、鐵氰化鉀等，均為分析純。

1.2儀器與設備熒光分光光度計（RF5301），日本島津公司；倒置熒光顯微鏡（NIKONTE2000-S）日本尼康公司；研磨珠均質器（Mini-Beadbeater-16）美國Biospec公司。

1.3方法

1.3.1茶多酚抑毒抑菌活性檢測采用96孔板培養法，對各種茶多酚單體的抑毒活性檢測。每孔含有沙氏液體培養基200μL（含有黃曲霉孢子1×105CFU/mL）。向各孔中分別加入各種茶多酚單體溶液，使各種茶多酚單體的濃度分別為5、10、25、50、100、200、400、800、1000μg/mL。加完茶多酚單體的96孔板放在28℃的培養箱中培養60h，然后對每孔培養基中的黃曲霉毒素進行檢測。同時根據每孔黃曲霉的生長狀況，記錄各種茶多酚單體抑制黃曲霉生長的MIC（肉眼可以觀察到的最低完全抑制濃度）。

1.3.2AFB1提取及含量測定吸取一定量黃曲霉培養濾液，加三倍氯仿萃取，萃取液于60℃下用氮吹儀吹干，溶解于甲醇中，過0.22μm微孔濾膜，然后用HPLC測定AFB1的含量。色譜柱：COSMOSIL5C18-MS-IIPackedColumn（4.6mmI.D.×250mm）（上海泉島公司）；柱溫：22℃；進樣量：10μL；檢測波長：365nm；流動相：乙腈：甲醇：水（1:1:2，V/V/V）；流速：1mL/min[13]。

1.3.3胞內活性氧（ROS）水平槲皮素處理過的黃曲霉及對照組經過24、36、48、60、72h的培養，分別采樣。取得的菌絲經磷酸緩沖液（PBS）洗滌后，加入20μmol/L活性氧熒光探針carboxy-H2DCFDA（Eugene,OR），在30℃條件下孵育30min；使用PBS洗滌兩次，然后加入1mLPBS緩沖液和0.1g小玻璃珠，通過Mini-BeadBeater-16（Biospec，USA）破碎菌絲；破碎的菌絲液在10,000g離心，取上清，通過考馬斯亮藍法測定其可溶性蛋白含量，并通過熒光分光光度計測定其熒光強度（激發光450nm，發射光520nm）。同時取部分未經過beater破碎的菌絲通過熒光顯微鏡觀察。

1.3.4脂質過氧化分析MDA的濃度可作為黃曲霉細胞脂質過氧化指標。槲皮素處理過的黃曲霉及對照組經過24、36、48、60、72h的培養，分別采樣。取得的樣品通過6,000g離心10min后收集菌絲，然后在2mL含有10%三氯乙酸中均質。勻漿在10,000×g離心10min，吸取2mL的上清液，與2mL的TBA溶液（0.25%TBA溶于10%TCA）混合。混合液在95℃條件下加熱30min，然后迅速冷卻，隨后在6,000g離心10min，上清液在532nm測其吸光度，在600nm測定非特異吸光度。MDA含量計算依據公式：C=6.45（D532-D600）-0.56D450

1.3.5SOD、CAT和POD活性測定POD酶活測定采用愈創木酚法[14]，取500mLpH6.0PBS緩沖液置于燒杯中，加入280μL愈創木酚，加熱溶解完全，冷卻至室溫后加30%過氧化氫190μL混勻，制成反應液。取3mL反應液加入0.5mL粗酶液，37℃溫育30min，于470nm波長下測定OD值。以37℃條件下，每毫克組織蛋白每分鐘催化產物生成1μg的底物酶量為一個酶活單位。SOD酶活測定采用NBT（氯化硝基四氮唑蘭）光還原法[14]。吸取2.4mL50mmol/LpH7.8磷酸緩沖液，加入0.2mL195mmol/L硫氨酸，0.1mL3μmol/LEDTA，0.2mL1.125mmol/LNBT，0.1mL核黃素60μmol/L，最后加入0.1mL粗酶液。加完1號管避光，其他管置于4000Lx日光燈下25℃準確反應10min，反應結束后所有管用黑布遮蓋以終止反應，避光管為對照，在波長560nm測定OD值。以每毫克蛋白在1mL反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為一個SOD活力單位。CAT活性測定：配制0.3%H2O2溶液作為底物溶液：吸5mL30%H2O2，用0.05mol/LpH7.0PBS定容到500mL。反應體系包含1mL0.3%H2O2溶液、1.9mLH2O、0.1mL酶液，測定OD240nm降低速度。將每毫克蛋白每分鐘OD減少0.01定義為1個活力單位。

1.3.6RT-PCR將黃曲霉菌接種在含有50mL沙氏液體培養基的三角瓶中，加入槲皮素，使其終濃度達到100μg/mL，放入28℃的搖床中，120r/min搖動培養。分別在48h（產毒前期），72h（產毒初期），以及96h（產毒中后期）取樣。通過2層紗布過濾除掉培養基，將獲得的菌絲放入液氮中速凍備用。菌絲體RNA采用試劑盒方法提取（Qiagen,Inc.，Valencia，CA，RNeasyplantminikit）；用LAMDA-25紫外可見分光光度計測定260和280nm的吸收值，由260nm吸收值計算RNA含量[15]，由OD260/OD280得知總RNA純度；取等量RNA進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，檢查RNA的完整性。將提取的菌絲總RNA用“FirstStrandcDNASynthesisKit”（TOYOBO，Japan）進行第一鏈cDNA的合成；引物序列和退火溫度參照表1。

1.4數據分析運用SPSS12.0數據處理系統，采用Duncan’s新復極差法（DMRT）進行顯著性分析。所有圖表數據的結果都是三次實驗數據的平均值±SD。

2結果與分析

2.1槲皮素對黃曲霉菌絲生長和毒素產生的抑制各種茶多酚單體和茶多酚混合物均表現出了對黃曲霉毒素的抑制作用，但是能夠在低于1000μg/mL完全抑制黃曲霉毒素產生的茶多酚單體只有GC、C、ECG、EGC和槲皮素（表2）。其中槲皮素的活性最強，在100μg/mL時就能完全抑制黃曲霉毒素產生。而且槲皮素是唯一能夠在低于1000μg/mL（800μg/mL）完全抑制黃曲霉生長的茶多酚單體（表2）。

2.2槲皮素處理緩解黃曲霉菌絲內氧化脅黃曲霉菌絲內氧化還原平衡狀態被證實與產毒密切相關[16]。槲皮素本身具有抗氧化活性，因此槲皮素可能會對黃曲霉菌絲的氧化脅迫水平產生影響。試驗結果表明槲皮素處理導致黃曲霉菌絲內ROS水平普遍低于對照（圖2a、b），在處理24h后僅為對照的38.72%，到處理后72h時，達到對照的68.23%，明顯緩解了黃曲霉菌絲內氧化脅迫。MDA含量分析結果表現出了相同的趨勢：槲皮素處理導致MDA水平下降，在處理24h后達到對照的63.83%，到處理后72h時，達到對照的68.98%（圖2c）；這表明槲皮素可以緩解黃曲霉菌絲脂質過氧化。

2.3槲皮素激發了黃曲霉體內抗氧化系統Yap1是抗氧化系統的轉錄因子，能夠啟動抗氧化系統的轉錄。RT-PCR結果顯示Yap1在產毒前期就被激活，轉錄水平大幅提升，而且在整個產毒過程一直處于較高的表達水平（圖3a、b）。進一步的抗氧化酶活性檢測結果確定了黃曲霉在槲皮素作用下抗氧化系統的激活，POD、CAT、SOD都得到了顯著的提高（圖4）。通過計算得出槲皮素處理導致黃曲霉菌絲POD活性增加了2.13倍，CAT活性增加了1.76倍以上，SOD活性增加了84.24%。

2.4槲皮素抑制產毒相關基因的表達黃曲霉產毒相關基因成簇存在于基因組內，其中AflR和AflS是調控基因。為了深入了解槲皮素對毒素產生抑制的機制，我們選擇了部分跟產毒相關的基因，并對它們的轉錄狀況進行了檢測。這些基因涵蓋了黃曲霉毒素合成相關基因簇的上、中、下游[17]。RT-PCR結果顯示無論是調控基因還是結構基因在槲皮素存在的條件下轉錄水平都發生了下調，但是下調程度各不相同（圖5a、b）。總的來說槲皮素對調控基因aflR和aflS的下調程度弱于對合成基因的下調程度；尤其aflK的轉錄對槲皮素處理的響應最明顯（圖5b）。這些結果暗示槲皮素可能通過下調調控基因來影響合成基因的轉錄，因為槲皮素的調控信號這個過程發生了放大現象。

3討論

據聯合國糧農組織（FAO）估計，每年全世界平均有2%的糧食由于霉變而不能使用，由黃曲霉毒素污染所造成的損失可達數千億美元。黃曲霉毒素的合成調控網絡非常復雜，至少25個基因參與了黃曲霉毒素的合成調控[16]。目前已發現的黃曲霉毒素抑制劑主要包含生物堿、抗生素、雙黃酮、鈣離子阻斷劑、香豆素類、黃酮類、氧肟酸、氧類脂、多烯不飽和脂肪酸、萜類化合物、某些揮發組分等[7]，但是關于它們的作用機制目前研究較少。黃曲霉菌體內的氧化還原狀態被證實與產毒密切相關[17]。槲皮素具有良好的抗氧化能力[9]，我們的研究結果證實，槲皮素處理能夠緩解黃曲霉菌的氧化脅迫狀態。但是槲皮素在各種茶多酚中不是抗氧化能力最強大的，其抑制毒素產生的能力卻最強。因此，除了自身的抗氧化能力，應該還有其他機制的參與。我們的研究結果表明，槲皮素能夠激活抗氧化系統轉錄因子Yap1，導致黃曲霉體內的抗氧化酶活性增加，這種誘導機制很可能是槲皮素抑制AFB1產生的關鍵因素。氧化還原平衡參與毒素產生調控主要是通過調控黃曲霉毒素調控基因AflR來實現的[17]。我們的研究發現槲皮素既能下調AflR的表達，又能下調AflS的表達。而AflS能夠通過結合AflR調控產毒基因的表達（圖6）。因此抑制AflR的作用很可能是槲皮素抑制AFB1產生的核心分子機制，這種機制也與其激活抗氧化系統緩解菌體內氧化脅迫的作用相對應。在AflR下調的情況下，產毒基因的表達會受到抑制。因此槲皮素處理的菌絲的產毒基因全面下調。

4結論

槲皮素處理能夠緩解黃曲霉菌的氧化脅迫狀態，激活抗氧化系統轉錄因子Yap1，下調黃曲霉調控基的表達，最終抑制了黃曲霉毒素的產生。因此槲皮素含量可以作為茶葉遭受黃曲霉毒素污染風險評估的重要參數，同時由于其本身的安全性和功能性，可以作為抗毒劑應用于食品行業中黃曲霉毒素污染控制。

作者：王淼焱張浩楊潔胡梁斌莫海珍單位：河南科技學院食品學院西北農林科技大學食品學院信陽茶葉試驗站