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1組織培養

1.1用組織培養的方法篩選耐鹽堿水稻突變體的研究吉林省西部有大量的鹽堿地，為充分挖掘西部鹽堿地水稻產量潛力，選育耐鹽堿的水稻新材料也是吉林省水稻工作的重點研究內容。延邊大學林延玉通過逐步提高培養基pH值的方法，對長白9號、珍富19、通35、延農1號等4個水稻品種進行愈傷組織的耐鹽堿突變體篩選。研究表明，珍富19的愈傷組織出愈率、出苗率、存活率以及農藝性狀等方面均要優于其它3個品種，其再生植株耐鹽堿性優于原品種種子植株。再生植株耐鹽堿性與愈傷組織耐鹽堿性有一定的關系，但也有一些差異。在種子萌發期，長白9號再生植株當代種子耐鹽堿性優于原品種種子，而再生植株當代種子2葉期幼苗耐鹽堿性不如原品種種子植株的2葉期幼苗，通35則相反。同時，對再生植株鹽堿鑒定條件也進行了研究。研究表明，種子萌發時期用19000mg/kg的NaHCO3溶液來進行，2葉期幼苗用16000mg/kg的NaHCO3溶液來進行，則鑒定效果較好。

1.2水稻耐冷突變體細胞系及其無性系研究吉林省作為東北粳稻主產區，每隔4～5年都會經歷一次低溫冷害，對吉林省粳稻的穩定生產造成一定影響。針對于此，吉林省農科院水稻所開展了水稻耐冷組培研究。金潤洲等1986年在來自粳稻種胚的愈傷組織中，用-3℃處理15～20d的方法，經多次選擇，獲得過耐冷愈傷組織系，但沒有分化出再生植株。金潤洲等將來自粳稻11個品種幼穗的愈傷組織，在15℃下繼代培養，每隔5d調查愈傷組織塊的直徑，發現在15℃冷溫下，第15～30d的愈傷組織凈生長量與供體品種孕穗期的耐冷性呈顯著的正相關。其中第25天的相關系數最大，達到1%極顯著水平(0.757**)。因此，提議在15℃下培養25d的愈傷組織凈生長量作為鑒定愈傷組織耐冷性的指標，在15℃下培養25d的方法，作為愈傷組織耐冷性的鑒定方法及選擇技術。用這種方法，經多次重復選擇，獲得了耐冷愈傷組織及其再生植株。同時，金潤洲等探討了氯酸鉀、聚乙二醇(PEG)、升汞等化學物質對愈傷組織生長的影響及其與品種耐冷性的關系。結果，在含有0.4%氯酸鉀的培養基上4個耐冷品種的愈傷組織35d后的平均凈生長量明顯大于5個敏感品種的平均值，大塊率(>5mm的愈傷組織塊占供試總塊數中的百分比)達39.3%，比敏感品種高3.7倍。說明來自耐冷品種的愈傷組織抗毒性明顯高于來自敏感品種的愈傷組織。1988年金潤洲等對未作任何因子處理的培養基中獲得的體細胞無性系自交二代(R2)進行了孕穗期耐冷性鑒定試驗，首次獲得了耐冷性明顯超親的體細胞無性系26份，首次證明了組織培養本身就是一種有效的耐冷性誘變技術。同時，從愈傷組織的生長量和綠苗分化率兩個方面對耐冷性的遺傳穩定性也進行了相關研究。愈傷組織的生長量:1987年金潤洲選用來自粳稻品種秋光(愈傷組織生長慢)和吉粳44號(生長快)種胚的愈傷組織，連續培養4代(每代30d)。結果無論在哪一個世代，生長快的吉粳44愈傷組織大塊率(在供試的愈傷組織總塊數中，直徑>8mm的塊所占的百分比)總是多于生長慢的秋光愈傷組織。在另一組試驗中，在15℃培養溫度下來自11個粳稻品種幼穗的愈傷組織生長量與供體品種孕穗期的耐冷性呈極顯著的正相關。即來自耐冷品種的愈傷組織生長量明顯大于來自不耐冷品種的愈傷組織生長量。說明愈傷組織生長量是與品種耐冷性有相關性的相對穩定的遺傳性狀。綠苗分化率:金潤洲的試驗結果，來自幼穗的愈傷組織綠苗分化率與供體品種的孕穗期耐冷性呈顯著的正相關。即品種耐冷性越強，其愈傷組織的綠苗分化率則越高。從雜種一代的綠苗分化率來看，在供試的6個雜交組合中5個組織的雜種一代綠苗分化率明顯高于不耐冷親本的綠苗分化率，相等或稍高于耐冷親本。認為綠苗分化率是受顯性基因控制的較穩定的遺傳性狀。

2分子標記技術研究

2.1分子標記輔助育種和種質漸滲研究利用基因組特異性分子標記可以檢測和促進有利基因從水稻野生種或其它物種向水稻栽培種的漸滲。樸亨茂等將菰等植物的DNA通過花粉管通道法導入水稻中，后代材料中獲得了多個具有優良特性的水稻材料。然而菰遺傳物質漸滲給水稻的直接證據缺乏。劉振蘭等以菰和水稻的基因組DNA為探針，通過點雜交，獲得了2個菰物種?；疍NA序列。并以這兩個序列為探針，與漸滲雜交系進行雜交分析，分析結果為菰導入水稻提供了確鑿的證據。初秀成等將柳葉菜科植物月見草(Oenotherabiennis)導入水稻品種通育211中，對D3-6代中代表性變異材料進行了AFLP分子標記分析，證明月見草的花粉介入確定使受體水稻在DNA分子水平上產生了大量的變異，但要確證這些材料中是否含有直接來自月見草的遺傳物質，還需要進行更深入的分子分析。

2.2遺傳連鎖圖譜的繪制利用分子標記可繪制遺傳連鎖圖譜，用于重要農藝性狀基因在染色體上的定位。祁棟靈等以粳粳交“高產106/長白9號”的F2-3代200個家系為作圖群體，以SSR標記構建的分子連鎖圖譜為基礎，對水稻幼苗前期的根數、根長和苗高及其相對堿害率進行了數量性狀基因座(QTL)的檢測。研究表明，上述性狀在F3家系群中均表現為具有1～2個峰的連續分布，認為由主效基因和微效基因共同控制的數量性狀。共檢測到與堿脅迫下幼苗前期根數、根長和苗高及其相對堿害率相關的QTL26個，分布于第1、5、6、7、8、9和11染色體上。其中，堿脅迫下與根數相關的QTL4個，qRN6-1和qRN11對表型變異的解釋率較大，分別為29.91%和13.42%；與根數相對堿害相關的QTL5個，qRRN11-2對表型變異的解釋率較大，為23.86%；與根長相關的QTL6個，QR-RL11-2對表型變異的解釋率較大，為21.06%；與根長相對堿害率相關的QTL2個，但對表型變異的解釋率均較低；與苗高相關的QTL5個，QSH1和QSH11-2對表型變異的解釋率較大，分別為15.81%和16.53%；與苗高相對堿害率相關的QTL4個，QRSH5和QRSH6-2對表型變異的解釋率分別為29.89%和34.63%。而這些解釋率較大的QTL所處的標記區間距離，除QRN6-1相對較小(19.0cM)外，其余QTL的標記區間距離均大于26.3cM，需作進一步的精細定位。在所檢測到的QTL中，13個QTL的增效等位基因均來自耐堿親本長白9號，而其余QTL的增效等位基因來自敏堿親本高產106；基因的主要作用方式為超顯性或部分顯性。

3轉基因研究

3.1抗病轉基因研究抗病轉基因研究一直是水稻轉基因研究的重點。林春晶等將溶菌酶基因通過基因槍轟擊法轉入水稻品種超產2號和豐優201中，R1代群體材料中轉基因植株的發病指數要低于對照，外源基因的轉入提高了水稻植株對稻瘟病的抗性水平。于彥春利用農桿菌介導法，將兩個抗白葉枯病基因CECROPINB和XA21導入水稻品種JY119株系，獲得了這兩個基因的單獨和共表達后的植株。接種3個不同白葉枯病菌后觀察轉基因植株與對照JY119株系發現，不論是單基因轉化，還是共轉化，轉基因植株均表現為比較明顯的抗性。從接種后發病的病斑長度來看，共轉化植株產生高抗白葉枯病的可能性要大于轉單抗白葉枯病基因材料。劉雪輝將浙江大學獲得的轉RCH10和AGLU1基因的抗紋枯病株系的遺傳穩定性及抗病性進行了分析。研究發現，在T6代中，NPTII基因全部得到保留，而15%的植株發生RCH10基因或AGLU1基因的丟失，其中1株被檢植株甚至丟失了RCH10和AGLU1雙基因。保留RCH10和AGLU1雙基因的T6轉基因植株在接種紋枯病菌后抗性均高于野生稻。劉瑞芳利用農桿菌介導法將水稻轉核糖體失活蛋白基因導入水稻品種豐優307、富源4號和吉粳88中，獲得抗性苗32株。采用離體葉片接種法對轉基因植株進行初步稻瘟病抗性鑒定，發現外源基因的轉入提高了水稻植株對稻瘟病的抗性水平。

3.2抗蟲轉基因研究林秀峰等利用農桿菌介導法，將蘇云金桿菌素毒蛋白基因CRYIA和半夏凝集素(PINELLI-ATERNATAAGGLUTININ，PTA)基因轉入水稻品種吉粳81、吉粳88和通887中，用除草劑草丁膦(PPT)篩選得到轉基因植株25株。水稻二化螟接蟲鑒定結果表明，23株轉基因植株抗蟲性比對照明顯提高，2株表現感蟲?？傮w來講，轉基因水稻比對照的抗蟲性明顯提高。

3.3抗除草劑轉基因研究王景余等應用基因槍法將抗除草劑基因(BAR)導入吉林省主栽水稻品種長白8號中，獲得了抗除草劑轉基因水稻植株。除草劑葉片涂布試驗，有3個轉基因水稻植株仍為綠色，表現對Basta除草劑有抗性，說明在陽性轉基因植株中抗除草劑基因整合到水稻基因組中并得到表達，使轉基因水稻植株產生抗性。

3.4生物反應器植物生物反應器是指利用植物懸浮細胞培養或整株植物為工廠生產具有重要功能的蛋白質，如：人或動物的疫苗、抗體、重要的氨基酸、具有重要藥用價值的蛋白或食品添加劑、工業原料的植物次生代謝產物等。目前，以水稻作為生物反應器在生產疫苗、工業酶制劑和工業可降解塑料及一些重要的藥用蛋白等研究已經取得了很大進展。張秀香以鸚鵡熱衣原保護性抗原基因momp基因和大腸桿菌熱不穩定腸毒素B亞單位ltb基因為研究對象，分別構建了表達MOMP基因和LTB-MOMP融合蛋白的原核表達載體，通過農桿菌介導法，將ltb-momp融合基因導入水稻植株中，通過抗性篩選及整合性鑒定，證明獲得了表達LTB-MOMP融合蛋白的轉基因水稻植株。維生素A(VA)是人體必需的營養元素，人體不能合成類胡蘿卜素，主要依賴飲食中類胡蘿卜素的供應，其中β-胡蘿卜素是其主要前體。目前為止，還未發現水稻胚乳能合成維生素A原的水稻栽培品種。王紀報選用植物類胡蘿卜素遺傳工程中的首選基因PSY以及編碼HIV-1病毒外膜蛋白的gp120基因作為目的基因，以水稻成熟胚誘導的愈傷組織為受體，分別通過農桿菌介導和基因槍轉化的方法將目的基因導入水稻，對獲得的抗性苗進行PCR、PCR-Southern檢測表明，目的基因已經整合到水稻基因組中。

3.5其它水稻轉基因研究管清杰利用RT-PCR技術，從水稻品種吉玉粳中克隆到水稻抗壞血酸過氧化物酶(APXa)目的基因片段。并將其轉入煙草中，獲得8株轉基因植株；楊柏明首次克隆了短芒大麥的液泡型Na+/H+逆向轉運蛋白基因HbNHX1，并利用農桿菌介導法將其轉入水稻中，獲得20株轉基因植株，為水稻抗逆遺傳改良提供了新材料。

4表觀遺傳學研究

申斯樂等用高壓誘變水稻，并對變異品系的DNA甲基化模式和基因組結構進行了研究。通過對原種及兩個變異品系基因組DNA分析，顯示原種及兩個變異品系不僅存在著基因組結構的變異，而且發生了DNA甲基化模式的改變。此外，研究發現原種和兩個變異品系異地栽種，其形態水平的變異可以穩定表達。范建成等研究了萘脅迫對水稻基因組DNA甲基化模式的影響。運用MSAP技術測定水稻純系品種日本睛和松前經萘染毒脅迫后，不同生長時期葉片基因組DNA甲基化變異的情況。水稻經萘脅迫后存在基于DNA甲基化水平和模式改變的表觀遺傳變異；5-甲基胞嘧啶百分含量的變化無統一趨勢或規律；全部檢測到的1051個位點中，日本睛有16.56%發生了變異，相對于松前的12.08%具有顯著差異，一定程度上說明抗萘脅迫能力與基因型有關：松前強于日本睛；不同基因型及不同生長時期DNA甲基化模式的變異存在明顯差異，表現為以去甲基化為主(0.48%～10.41%),由此推測DNA去甲基化可能是植物抗萘脅迫機制的一部分。

5基因克隆及功能驗證

趙增琳用PCR方法從水稻基因組中克隆了單加氧酶基因，構建原核表達載體，使之在大腸桿菌中得到表達。并通過吲哚生成靛藍實驗測定單加氧酶活性，以空載體為對照，單加氧原核表達蛋白活性明顯增強；構建真核表達載體，轉化擬南芥，發現轉基因擬南芥能夠耐受50℃高溫及UV-B紫外線輻射。李世鵬用PCR的方法克隆了兩個水稻I型金屬硫蛋白基因啟動子，將其分別插入pCAMBIA1381載體，構建了啟動子與GUS基因雙元表達載體，轉化擬南芥，對其進行了功能分析。

6問題與展望

目前，吉林省在水稻基因工程育種方面已取得不少進展，但是還缺乏基因的高效發掘技術，實用分子標記也較少，許多重要目標性狀基因尚需緊密標記。同時，水稻組織培養技術存在一定的缺陷，比如出愈率、綠苗分化率都還不夠高，影響后代基因型的充分表達，因此有待于在應用中進一步完善。加強基礎研究，弄清楚細胞脫分化和發育的分子機制。加快基因工程與細胞工程的整合，并進一步完善技術體系。

作者：王金明林秀云孫強單位：中國農業科技東北創新中心吉林省農科院水稻所