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《中國生物工程雜志雜志》2014年第七期

1方法

1．1病毒繁殖、純化及RNA抽提ibvH52毒株經尿囊腔接種10dSPF雞胚增殖后，用PEG20000透析濃縮，經SDS-PROK方法抽提RNA，直接進入逆轉錄體系。

1．2RT-PCR和cDNA克隆參照報道IBVBeaudete株N基因序列設計一對引物［8］:引物P1:5''''GGATCCATGGCAAGCGGTAAAGCAG3''''，對應于N基因ORF的1～19位，含BamHⅠ位點和ATG起始密碼子;引物P2:5''''CCGAGCTCTCAAAGTTCATTCTCTCC3''''，對應于N基因ORF的1211～1230位，含SacⅠ位點和終止密碼子。引物由北京奧科生物公司合成，使用前稀釋成終濃度20mmol/L。RT-PCR以10μl病毒RNA為模板，按Promega公司cDNA合成說明書合成cDNA第一鏈，再以cDNA第一鏈為模板，PCR擴增整個基因，反應條件為94℃30s，50℃45s，72℃1min30s，35個循環后72℃10min。PCR產物經鑒定后按試劑盒操作方法克隆到pMD18-T載體中，構建pT-NP質粒，并轉入E．coliDH5α克隆并用于測序。

1．3序列測定及分析重組質粒經北京奧科生物技術公司測序，然后將序列測定結果與GeneBank中的有關數據進行同源性分折。

1．4重組表達載體的構建將pT-NP和pGEX-KG分別用BamHⅠ和SacⅠ酶切，回收1．2kb左右的N基因片段與用相同的酶消化的pGEX-KG片段，T4連接酶在16℃定向連接構建GST融合表達載體pGEX-NP。重組表達載體轉化E．coliDH5α感受態細胞，用含氨芐青霉素的LB瓊脂平板進行篩選培養，并對陽性進行PCR及酶切分析鑒定。

1．5轉化菌的誘導表達及表達產物的檢測純化將鑒定正確的重組質粒分別轉入宿主菌E．coliBL21(DE3)進行篩選誘導表達，轉化菌的表達產物的提取按pGEX表達系統操作手冊進行。表達產物的SDS-PAGE電泳和Westernblot分析按參考文獻［9］進行，目的蛋白的純化按Hi-TrapGST純化柱的操作說明進行。

1．6間接ELISA方法的建立酶聯免疫吸附試驗(ELISA)最佳反應條件的選擇:通過方陣滴定方法，確定抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度。抗原從1∶20稀釋到1∶640，血清從1∶10稀釋到1∶320，按其稀釋度分別加到酶標板的1至6行和1至6列，陰性血清按陽性血清同樣的稀釋度加到第7至12列，按間接ELISA方法進行操作，測定OD450值，計算陽性OD值比陰性OD值(P/N值)，結果最大的孔所對應的抗原包被濃度和血清稀釋度，判為最佳抗原包被濃度和血清稀釋度。結果判定標準的確定:將臨床未經免疫的144份雞血清，進行ELISA檢測，計算平均值x，標準差s，陰陽界限值按計算公式:x+3s確定。重復性試驗:用相同批次、不同批次的酶標板，對抗體水平不同的6份血清樣品進行批內、批間重復性測定，參照參考文獻［10］計算批內、批間的吸收變異系數。交叉性試驗:分別檢AIV、NDV、IBDV、EDS76等禽常見病毒的標準陽性血清，同時設陽性血清、陰性血清和空白對照。阻斷試驗:將IBVH52陽性的雞胚尿囊液與等體積IBV陽性血清混合，37℃作用45min，作倍比稀釋，ELISA檢測，同時設不做任何處理的正常尿囊液和陽性血清混合物作為對照。診斷特異性、敏感性與符合率試驗:選用國內外公認的檢測方法，即血凝抑制試驗(HI)作為參照試驗方法，與本研究建立的ELISA診斷方法相比較，確定該ELISA診斷方法的診斷特異性、敏感性與符合率。血凝抑制試驗(HI)按OIE手冊中方法進行［11］。間接ELISA的應用:用建立的ELISA方法檢測江夏、新洲、黃陂等地區臨床送檢的400份血清。

2結果

2．1N基因的克隆

RT-PCR產物電泳顯示，目的片段在1．2kb左右，將目的基因回收后連到pMD18-T載體轉入E．coliDH5α，提取質粒，用BamHI和SacⅠ雙酶切切出1．2kb、2．7kb左右的兩條帶，用BamHI單酶切僅一條(圖1)，這說明所挑選的克隆產物為目的基因正向插入質粒，其大小與預期一致。通過測序，測得N基因序列長度為1230bp，編碼409個氨基酸，涵蓋了從ATG至TGA一個完整的閱讀框。通過NCBIBLAST方法進行分析，該基因與LKQ3(H52)毒株同源性最高，為97%，以上表明擴增片段為目的基因。

2．2表達載體構建及鑒定

將pGEX-NP質粒轉化的細菌經培養，挑取單個菌落培養用于小量制備質粒DNA，并通過酶切、PCR篩選正確插入目的基因的重組質粒。結果顯示，BamHⅠ和SacⅠ雙酶切產物電泳后可見清晰的1．2kb和4．9kb的2條帶;經BamHI單酶切消化，電泳后可見一條大小約6．1kbDNA帶(圖2)。這說明我們獲得了正確插入目的基因的陽性克隆。

2．3表達產物的SDS-PAGE和Westernblot分析

SDS-PAGE電泳結果顯示:含pGEX-KG的E．coliBL21的對照在約26kDa有明顯的表達帶，相當于GST蛋白的大小，含重組質粒pGEX-NP的大腸桿菌在約80kDa處有明顯的表達帶，相當于N蛋白與GST蛋白融合表達的產物，結果表明目的基因在重組菌中獲得了表達;經掃描分析，在IPTG誘導3h左右的細菌中，該蛋白表達量占總蛋白量的25%，達到最高(圖3)。Westernblot分析表明:重組表達的80kDa蛋白帶，能與IBV的標準陽性血清發生特異性的免疫反應，證實表達產物具有很好的免疫學活性(圖3)。

2．4NP-ELISA的建立與應用

2．4．1NP-ELISA最適條件及陰陽界限的確定試驗表明抗原的最佳包被濃度為1．75μg/ml，抗原最佳稀釋度為1∶40，血清最佳稀釋度為1∶80，陰性血清平均OD值x等于0．178，s等于0．061，求得陰陽界限為x+3×s=0．178+3×0．061=0．361。結果判定標準的確立:以空白孔調零為背景，在酶標儀上測各孔OD450值，若OD450≥0．361判為血清抗體陽性，表明疫苗免疫雞群產生了相關抗體或非免疫雞群受到了野毒的感染;若OD450＜0．361判為陰性。

2．4．2交叉性試驗結果表明無關病原抗體OD值均在臨界值0．361以下，說明此方法與AIV、IBDV、NDV、EDS76等病原抗體無交叉反應，特異性強(表1)。

2．4．3重復性試驗結果表明批間重復的吸收變異系數在3．62%～9．49%之間，批內重復的吸收變異系數在3．29%～7．97%之間，說明該診斷方法具有良好的重復性。2．4．4診斷特異性、敏感性與符合率試驗HI試驗和ELISA試驗檢測同一批血清的陰陽性結果如表2所示，結果顯示，以HI試驗作為參照，ELISA試驗的診斷敏感性為97．29%，特異性為60．60%，符合率為88．89%，說明該方法具有良好的診斷特異性、敏感性與符合率(表2)。2．4．5阻斷試驗可以看出經含IBV的尿囊液處理的陽性血清OD值明顯降低，而經健康雞胚尿囊液處理的陽性血清的OD值沒有明顯變化(圖4)。2．4．6間接ELISA在臨床的應用統計表明，臨床樣品的陽性率為89．0%，這說明NP-ELISA方法能很好地應用于臨床IBV抗體檢測(表3)。

3討論

核衣殼蛋白(N)是IBV的3種主要結構蛋白之一，在遺傳進化中最為保守，不同毒株間同源性最高(達94%～99%)，病毒感染過程中表達量最大(S∶M∶N3種蛋白的摩爾比為1∶6∶15)，與病毒的組裝和機體細胞免疫等方面有重要相關性，因此研究N蛋白基因的克隆表達對該病有重要的意義。本研究中，將外源基因插入在GST蛋白基因的下游，表達出可溶性的融合蛋白GST-NP，利用GST親和層析柱進行了純化。高純度表達蛋白的獲得為ELISA檢測方法的建立奠定了良好的基礎，特別是在克服動物體內大腸桿菌抗體對檢測方法的干擾方面有重要的意義。純化的產物有兩種，一種蛋白表達量高，片段較大，為主要產物，另一種表達量較低，片段較短，是附帶產物，這與相關融合報道的情況相同，可能是蛋白表達時部分蛋白在C端提前終止或發生了降解。Westernblot分析與ELISA試驗均表明，純化后兩種主要表達蛋白均具有很好的免疫學生物活性。

用大腸桿菌表達的重組N蛋白取代原病毒作為診斷抗原，是診斷技術發展的一種趨勢，優勢有以下幾點:首先，重組N蛋白具有良好的免疫原性，發現在大腸桿菌中表達的Gray株N蛋白可與多種血清型IBV抗體發生良好反應。其次，目前傳染性支氣管炎病毒的檢測方法有兩種，分別是病原學方法和血清學方法。N蛋白可作為抗原進行血清學檢測，保守性好，可以檢測各種血清型的抗體，不存在病原檢測中范圍狹窄的問題，具有更高可信度。再者，該蛋白易于制備純化，成本廉價，建立的檢測方法安全性好、診斷對象單一，準確性高，從制備、應用效果上均優于昆蟲細胞表達的N蛋白，該蛋白對將來IB新型疫苗的研制和IBV的消除必然有一定的意義。

為對ELISA方法的特異性、敏感性與符合率進行評定，本實驗進行交叉性、阻斷性、重復性試驗，同時將NP-ELISA診斷方法與血凝抑制試驗(HI)相比較，結果表明NP-ELISA檢測的敏感性、符合率很高，但特異性稍微偏低，這可能由于兩種方法的診斷原理和判斷標準不同所致。首先，靈敏度不同，HI雖是一種比較公認的檢測方法，但其靈敏度不高，而ELISA可達到血清中和試驗的2．3倍，AGP的188倍，具有很高靈敏度;其次，兩種方法檢測的對象不同，NP-ELISA專一性地檢測NP蛋白抗體，診斷對象單一，影響因素少，非特異性小，而HI則是檢測胰酶消化過的IB病毒，其中胰酶本身、鹽離子濃度、溫度等對血凝性都具有很大的影響，影響因素多，特異性差;再者，實驗穩定性不同，ELISA可以通過一系列的量化方法控制反應條件，而HI實驗極易受胰酶消化效果和病毒的類型等不可量化控制的條件影響。所以NP-ELISA與HI相比的特異性偏低，僅能表明本方法的敏感性比HI更高，穩定性更好，更適合于動物免疫或感染后早期抗體監測。

作者：李中華肖運才畢丁仁胡思順吳仁蔚單位：福建省動物疫病預防控制中心華中農業大學動物醫學院