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《中國生物工程雜志雜志》2014年第七期

1方法

1．1蛋白質濃度測定采用Lowry法，以牛血清白蛋白(BSA)為標準品。

1．2橄欖油乳化取10ml橄欖油與7．5ml5%TritonX-100混合，借助超聲波破碎儀(Dutycycle:30%Outputcontrol:40%)乳化7．5min。

1．3脂肪酶活性測定和活性單位定義游離脂肪酶活性:參照TOYOBO公司方法并做改良。取1ml底物(乳化橄欖油與0．1mol/LpH4．0檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液按照1∶4的比例混合)與50μl酶液混合，于50℃孵育并準確反應10min，加入1ml0．4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液終止反應。將反應液12000g離心5min，取50μl上清液與1ml顯色液(50UGK、125UGPO、75UPOD、0．5ml2%MgCl2•6H2O、0．5mlATP-Na•3H2O、0．2ml0．5%4-氨基安替比林和0．5ml40mmol/LTOOS依次溶于50mlpH6．550mmol/LMES緩沖液)混合，37℃反應30min，在555nm處測定其光吸收值。固定化酶活性:稱取適量的固定化脂肪酶干粉與0．85ml0．1mol/LpH4．0檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液混合，浸泡10min后加入0．2ml乳化橄欖油開始反應，其它操作過程同游離脂肪酶活性測定。酶活性單位(U)的定義:在上述條件下，每分鐘催化生成1μmol甘油所需的酶量為一個活力單位。

1．4脂肪酶的固定化取適當稀釋的0．4ml酶溶液、0．1ml1．0mol/LNaF、0．2ml4%聚乙烯醇、ddH2O和硅烷試劑混合，在漩渦震蕩儀上劇烈震蕩5s并輕搖20s，置于冰水中10min后凝膠形成，室溫下直立放置24h，真空抽氣干燥4h后于37℃孵箱自然干燥。將干燥的凝膠研成細微粉末，加入5mlpH7．50．1mol/L磷酸緩沖液，置于搖床上震蕩1h，過濾，收集濾液并重復洗一次，收集濾液。再加入5ml丙酮，震蕩1min，抽濾，粉末于37℃孵箱自然干燥12h，稱重，室溫保存備用。

1．5固定率的測定采用Lowry法測定洗滌濾液的蛋白含量，按公式:固定率=(總蛋白量－濾液中總蛋白量)/總蛋白量×100%計算。

1．6固定化脂肪酶相對活性固定化脂肪酶活性所占同等質量的游離脂肪酶活性的比例作為固定化脂肪酶的相對活性，并定義相同質量的游離脂肪酶活性為100%。按下列公式計算:OD550固:測定固定化脂肪酶活性的顯色液在550nm的光吸收值;OD550游:測定游離脂肪酶活性的顯色液在550nm的光吸收值;m1:固定化脂肪酶的總質量;m2:測定游離脂肪酶活性時游離脂肪酶的蛋白質量;m3:測定固定化脂肪酶活性時固定化脂肪酶的質量;m4:加入固定的總脂肪酶的蛋白質量。

1．7底物濃度對固定化脂肪酶活性的影響以乳化橄欖油為底物，橄欖油濃度設置為2．85mmol/L～114．03mmol/L，在pH4．0和50℃條件下考察游離脂肪酶與固定化脂肪酶活性，通過Lineweaver-Burk雙倒數法作圖求其Km值。

1．8pH對固定化脂肪酶活性的影響以乳化橄欖油為底物，在pH3．0～12．0(pH3．0～pH6．0為檸檬酸-檸檬酸鈉，pH7．0～pH8．0為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉，pH9．0～pH12．0為甘氨酸-氫氧化鈉)0．1mol/L緩沖液和最適溫度50℃下測定酶的相對活性，與游離脂肪酶比較考察pH對固定化脂肪酶的影響。

1．9溫度對固定化脂肪酶活性的影響以乳化橄欖油為底物，在最適pH4．0和35℃～75℃條件下，與游離脂肪酶比較考察溫度對固定化脂肪酶的影響。

1．10固定化脂肪酶穩定性酸堿穩定性:將游離脂肪酶與固定化脂肪酶在4℃和不同pH條件下處理6h，然后以乳化橄欖油為底物，在最適溫度50℃和最適pH4．0條件下測定游離脂肪酶與固定化脂肪酶活性。溫度穩定性:將游離脂肪酶和固定化脂肪酶分別在pH6．0和不同溫度(60℃、65℃、70℃和75℃)下孵育不同時間，然后在最適溫度50℃和最適pH4．0條件下測定酶活性。固定化脂肪酶反復使用穩定性:將2g固定化脂肪酶粉末與4ml0．1mol/LpH4．0檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液混合裝入微型層析柱，并用同樣的緩沖液平衡層析柱。將柱置于50℃保溫箱中，以2．0ml/min流速用蠕動泵循環打入16ml底物(由10ml乳化橄欖油和6ml0．1mol/LpH4．0檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液組成)于柱中，循環0．5h。將柱中反應液全部打出并收集備用。將每次反應液10000g離心5min，吸取20μl上清加入1ml顯色液中，37℃保溫30min，于550nm測定光吸收值。保存穩定性:將固定化脂肪酶分裝，封口，置于室溫避光保存。以乳化橄欖油為底物，間隔15d測定固定化脂肪酶活性。

2結果與分析

2．1硅烷試劑對固定化脂肪酶的影響本文選取了TMOS、MTMS、ETMS和PTMS4種硅烷試劑作為前驅體，分別對黑曲霉脂肪酶進行固定化。經測定各種配方的固定率與相對活性見表1，從表中可以看出，前驅體為PTMS∶TOMS=5∶1時，固定率最高，但固定化酶活性有所損失，相對活性只保留了66．5%;前體為ETMS/TMOS=5∶1時，固定化對脂肪酶有激活作用，相對活性高達136．3%，故以下實驗將此固定化酶樣品作為測試對象探討其基本特性。另外也觀察到，前驅體僅為TMOS時，在固定化過程中，凝膠過程瞬間完成造成凝膠不均一而且大量放熱使脂肪酶失活。而前體僅為ETMS或PTMS時，溶膠難以形成凝膠，需加入一定的TMOS可加速凝膠成型。

2．2水與硅烷分子比對固定化脂肪酶的影響對固定化脂肪酶活性有重大影響的另一個因素是水與硅烷的分子比例。在以ETMS/TMOS=5∶1為前驅體的固定化過程中加入不同量的水，測定其相對活性結果見圖1，可以看出在水與硅烷分子比例較低時，固定化酶的相對活性較低，究其原因可能是由于水分子太少時，整個溶膠體系分散不均勻;在水與硅烷分子比例大于10時，固定化酶活性開始降低，這可能是與凝膠時一些水分子不能凝入膠體中使得溶于這部分水的脂肪酶未能固定入膠體內有關。

2．3固定化脂肪酶米氏常數(Km)的測定以乳化橄欖油為底物，在pH4．0、50℃時測定游離脂肪酶與固定化脂肪酶在不同底物濃度下的相對活性。通過Lineweaver-Burk雙倒數法作圖求得游離脂肪酶與固定化脂肪酶的Km值分別為2．789×10-4mol/L和1．899×10-4mol/L(圖2)。脂肪酶在固定化之后Km有所降低，提示脂肪酶經固定化后，對乳化橄欖油的親和性增加，這可能是由于固定材料的疏水性使得底物更易接近酶活性中心。

2．4pH對固定化脂肪酶活性的影響以乳化橄欖油為底物，在不同pH環境和50℃條件下，pH對游離脂肪酶與固定化脂肪酶的活性的影響結果見圖3，從圖中可以看出，游離酶與固定化酶的最適反應pH均為pH4．0，但游離酶僅在pH4．0左右狹小范圍內具有較高活性，而固定化脂肪酶卻能在pH4．0～pH5．5較廣范圍內保持95%以上的相對活性。

2．5溫度對固定化脂肪酶的影響以乳化橄欖油為底物，在pH4．0和不同溫度的條件下，溫度對固定化脂肪酶與游離脂肪酶的活性的影響結果見圖4，從圖4中可以看出，固定化酶和游離酶的最適反應溫度分別為60℃和50℃，固定化脂肪酶的最適反應溫度較游離脂肪酶提高了10℃。

2．6固定化脂肪酶的酸堿穩定性以乳化橄欖油為底物，將游離脂肪酶與固定化脂肪酶在50℃和不同pH緩沖液中處理6h，然后在最適pH4．0下測定反應活性，結果見圖5。脂肪酶在固定化之后，它的酸堿穩定性顯著被提升，在所測試的廣泛酸堿范圍內(pH4．0～pH12．0)均能保持活性不變，這為其在工業應用上提供了具有說服力的實驗依據。

2．7固定化脂肪酶的溫度穩定性以乳化橄欖油為底物，將游離脂肪酶與固定化脂肪酶在最適pH6．0和不同溫度下處理不同時間，然后圖5在4℃和不同pH條件下處理6h的固定化脂肪酶酸堿穩定性Fig．5pHstabilityofimmobilizedlipasetreatedat4℃indifferentpHfor6h□:Indicatedimmobilizedlipase;■:Indicatedfreelipase在最適條件下測定殘余酶活性，獲得的結果見圖6。結果顯示游離脂肪酶與固定化脂肪酶在60℃處理后均可顯示較好的熱穩定性;在65℃和70℃處理后，固定化酶的熱穩定性優于游離脂肪酶;在75℃處理后，兩者熱穩定性沒有明顯的差異。

2．8固定化脂肪酶反復使用和保存穩定性以乳化橄欖油作為底物，分析不同使用次數后固定化酶活性，獲得實驗結果見圖7所示，從圖7中可以看出固定化酶在重復使用12次后仍能保留71．7%活性，但其活性隨著反復使用次數的增加而有所降低，可能是在反復使用中對脂肪酶的活性中心造成了傷害。將固定化脂肪酶置于室溫密封保存，間隔15d測定其保留的酶活性，結果見圖8。從獲得結果可以反映出，隨著保存時間的延長，固定化脂肪酶活性有所下降，在保存180d后仍能保留79．2%活性。

3討論

本文以幾種硅烷試劑作為前體，采用溶膠凝膠法進行了黑曲霉脂肪酶固定化研究。優化了固定化方法并測定了固定化酶的基本性質。在溶膠過程中，脂肪酶被包埋于溶膠，形成的二氧化硅骨架網中的空間剛好適合脂肪酶的大小，既不會擠壓脂肪酶使之空間構象發生改變，也不會空間過大使脂肪酶容易脫落［8］。固定率達到了80．2%，究其原因可能是在固定化時一些脂肪酶固定在了凝膠表面或者吸附在了凝膠表面，在用水溶液和有機溶液清洗時掉落［9］。固定化脂肪酶的活性相對于游離脂肪酶有所提高，可能的原因有四點:第一，脂肪酶在凝膠中充分地被分散和分布;第二，脂肪酶中疏水性結構域與載體材料中的有關疏水基團發生相互作用，導致脂肪酶比活增強;第三，脂肪酶固定化后Km值降低，表明固定化脂肪酶對乳化橄欖油的親和性增強;第四，載體材料中的PVA的有關基團提供了親脂性環境，提高了脂肪酶的活性中心的催化能力［10］。Dosanjh等［11］報道，用不同的載體通過吸附法固定脂肪酶，其最高相對活性可達98%，但是在24h后會有10%左右的活性被丟失。相對而言，本文采取的固定化方法能保證脂肪酶得到更高的相對活性。固定化脂肪酶較非固定化酶具有許多優勢，在一定的反應pH范圍和反應溫度范圍能夠保持高活性。固定化脂肪酶在堿性條件更穩定，可能是因為疏水性骨架網絡將脂肪酶較緊密地包裹，使得酶只能形成一層或兩層水分子構成的水化層，所以溶液中H+濃度發生大的改變也只能對脂肪酶造成較小的影響。固定化脂肪酶在70℃、75℃時更加穩定，可能二氧化硅骨架網絡可以隨著酶的構象改變而改變并有助于其恢復自然構象。這些性質都提示固定化脂肪酶有更廣泛的應用前景。

作者：李剛銳李林俐范翔孟延發單位：四川大學生命科學學院/生物資源與生態環境教育部重點實驗室