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《植物遺傳資源學報》2016年第三期

摘要:

利用149對具有多態(tài)性的InDel引物對473份黃瓜初選核心種質(zhì)自交系進行遺傳多樣性分析。采用3種方法12種取樣比例對該初級遺傳多樣性固定群體進行抽樣獲得候選多樣性固定核心樣本集(GDFCC)，使用等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon's信息指數(shù)(I)、基因多樣性指數(shù)(genediversity)、多態(tài)性信息含量(PIC)、總等位位點數(shù)(totalnumberofloci)、等位位點保留百分率(retentionrateofloci)評價候選多樣性固定核心樣本集的多樣性和代表性，結(jié)果表明，采用逐級聚類+稀有基因優(yōu)先取樣法并按照15%取樣比例構(gòu)建出的多樣性固定核心樣本集的效果較好。比較發(fā)現(xiàn)，該核心樣本集的Ne、I、基因多樣性指數(shù)和PIC值均接近或高于初級遺傳多樣性固定群體，且對原始群體的等位位點的保留百分率為99.68%。入選多樣性固定核心樣本集的材料來自15個國家和國內(nèi)18個省市。該研究為今后黃瓜優(yōu)異基因資源的挖掘利用提供了代表性強、覆蓋度廣、遺傳穩(wěn)定的研究群體，將有利于黃瓜種質(zhì)資源的高效研究利用。

關(guān)鍵詞:

黃瓜;InDel標記;核心種質(zhì);遺傳多樣性固定群體;遺傳多樣性

黃瓜(CucumissativusL．)屬于典型的異花授粉作物，是世界普遍栽培的重要蔬菜。由于黃瓜雜優(yōu)品種的大面積推廣，栽培品種的遺傳背景變得越來越狹窄，拓展黃瓜作物的遺傳多樣性顯得十分必要。我國國家蔬菜種質(zhì)中期庫收集黃瓜資源2000余份，其中絕大部分屬于地方品種，遺傳雜合度高，嚴重制約了資源的研究和利用。雖然研究人員對黃瓜種質(zhì)資源開展了一系列表型［1-6］和分子多樣性鑒定［6-10］以及核心種質(zhì)研究［11-15］，但是前人的研究多基于有限的典型材料和天然混交的原始種質(zhì)，研究結(jié)果在指導資源庫大量資源的研究和利用中的作用非常有限。為了提高作物遺傳多樣性鑒定和核心種質(zhì)研究結(jié)果的效度，英國國際園藝研究中心的G．J．King等［16］提出了多樣性固定基礎(chǔ)群體(DFFS)的概念，即代表某物種基因庫內(nèi)多樣性的、遺傳固定的自交系收集品種。他們在構(gòu)建蕓薹屬作物核心種質(zhì)的基礎(chǔ)上，通過小孢子培養(yǎng)和連續(xù)多代自交的方法，構(gòu)建了3個多樣性固定基礎(chǔ)群體并得到了有效應(yīng)用，這為我們解決上述資源研究中的問題提供了有益的借鑒。InDel分子標記與SSR標記所反映出的基因組遺傳信息不盡相同，具有多態(tài)性高、特異性強、穩(wěn)定性好、檢測容易、在基因組分布廣等優(yōu)點，在水稻［17-18］、玉米［19］、大白菜［20-21］、甘藍［21-22］等作物上應(yīng)用較多，在黃瓜苦味基因挖掘［23］、品種純度鑒定［24］和抗病基因定位［25-27］等方面也有應(yīng)用。本研究基于黃瓜表型初選核心種質(zhì)多代自交構(gòu)建的初選遺傳多樣性固定群體，利用黃瓜重測序信息設(shè)計的分布于黃瓜7條染色體上的149對InDel標記對其遺傳多樣性進行分析，結(jié)合多種取樣方法和取樣比例構(gòu)建多樣性固定核心樣本集，為促進黃瓜種質(zhì)資源高效研究和利用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1．1試驗材料試驗材料為基于國家蔬菜種質(zhì)資源中期庫保存的2000多份國內(nèi)外黃瓜種質(zhì)資源構(gòu)建的表型初級核心種質(zhì)經(jīng)過多代自交形成的473份自交系，即初級多樣性固定群體，其中來自印度、埃及、匈牙利、美國、俄羅斯、日本等35個國家的材料116份，來自中國東北、華北、華中、華東、華南、西北、西南等7個地區(qū)的材料357份(表1)。

1.2試驗方法

1.2.1DNA提取在黃瓜植株4葉1心時，每份材料選5個生長正常單株的幼嫩葉片作為混合樣品，采用改良CTAB法提取基因組DNA。使用微量分光光度儀檢測DNA濃度，采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度和完整性。最終稀釋濃度至20ng/L，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2PCR擴增與產(chǎn)物檢測InDel引物根據(jù)黃瓜基因組重測序預測得到的InDel位點設(shè)計，這些引物分布于黃瓜的7條染色體上。引物由英杰生命科技有限公司(Invitrogen)合成，通過試驗篩選出多態(tài)性引物149對(表2)，建立并優(yōu)化反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)體系為15μL，其中DNA模板(15ng/μL)2μL，10×Buffer1.5μL，Mg2+(25mM)1.2μL，dNTP(2.5mM)0.2μL，上游引物(10uM)0.2μL，下游引物(10uM)0.2μL，Taq酶(2.5U/μL)0.2μL，ddH2O9.5μL。反應(yīng)程序為:94℃5min;94℃30s，56℃30s，72℃1min，25個循環(huán);72℃7min;4℃保存。反應(yīng)產(chǎn)物用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染拍照。

1.2.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析對InDel擴增產(chǎn)物進行統(tǒng)計，有帶記為“1”，無帶記為“0”，缺失記為“9”，并將原始數(shù)據(jù)分別轉(zhuǎn)換為用于PowerMarkerV3.25軟件和Popgen3.2軟件使用的數(shù)據(jù)類型。使用PowerMarkerV3.25軟件分析總等位位點數(shù)(totallo-ci)、等位位點保留百分率(retentionrateofloci)、基因多樣性(genediversity)、多態(tài)性信息含量(PIC)，使用Popgen3.2軟件分析等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon's信息指數(shù)(I)。使用Pow-erMarkerV3.25軟件和MEGA6.06，計算群體遺傳距離(Nei'1972)并采用UPGMA法對群體進行遺傳相似性聚類并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4多樣性固定核心樣本集構(gòu)建分別采用3種取樣方法，即分組隨機取樣法、分組聚類+稀有基因優(yōu)先取樣法和逐級聚類壓縮+稀有基因優(yōu)先取樣法，均分別按5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的比例對初級多樣性固定群體進行取樣，即每種方法按不同比例抽樣構(gòu)建出12個候選多樣性固定核心樣本集，3種方法共構(gòu)建36個候選多樣性固定核心樣本集。

1.2.4.1分組隨機取樣法將473份初級多樣性固定材料按品種來源地分為9組，分別為國外組、東北組、華北組、華中組、華東組、華南組、西北組、西南組、其他(來源地不明)。按照12個取樣比例，分別在9個組中進行隨機取樣，具體取樣數(shù)量見表3。各組按比例取樣后，將按相同比例所取樣品進行合并，構(gòu)成12個候選多樣性固定核心樣本集。1.2.4.2分組聚類+稀有基因優(yōu)選取樣法使用PowerMarkerV3.25軟件利用分子數(shù)據(jù)分別計算9組材料的遺傳距離，根據(jù)遺傳距離分別進行聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。根據(jù)聚類結(jié)果，各組按12個取樣比例分別對具最遠遺傳距離的樣品進行優(yōu)先抽取。此外，對每個InDel引物擴增出的位點按其出現(xiàn)的頻率進行分類，對具有稀有等位基因位點(基因頻率＜5%)的樣品進行優(yōu)先取樣。各組按比例的取樣數(shù)量參照分組隨機取樣法，取樣后將各組按相同比例所取樣品進行合并，構(gòu)成12個候選多樣性核心樣本集。

1.2.4.3逐級聚類+稀有基因優(yōu)先取樣法使用PowerMarkerV3.25軟件計算所有樣品間的遺傳距離，根據(jù)遺傳距離進行聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。根據(jù)聚類分組結(jié)果，按12個取樣比例進行逐級聚類取樣，即從最低分類水平組內(nèi)(樣品間差異最小)的2個樣品中隨機取一個樣品或優(yōu)先選取其中具有稀有基因位點的樣品，而另外一個樣品被剔除，入選的樣品和其他保留下來的樣品進入下一輪聚類分析，若組內(nèi)只有一個樣品則直接進入下一輪聚類分析;對保留下來的樣品再次計算遺傳距離并進行聚類分析，按照相同的方法取樣，再進入下一輪聚類分析和取樣，直到剩余樣品量達到相應(yīng)比例要求的樣本量范圍，就構(gòu)成了該比例的候選多樣性核心樣本集，即12個候選核心樣本集。

1.2.5不同候選多樣性核心樣本集的評價與比較分析3種方法構(gòu)建的36個候選核心種質(zhì)的平均等位基因數(shù)、總等位位點數(shù)、等位位點保留百分率、有效等位基因數(shù)、Shannon's信息指數(shù)、基因多樣性、多態(tài)性信息含量等參數(shù)，對不同候選多樣性固定核心樣本集進行評價和比較，最終選出最優(yōu)的候選多樣性固定核心樣本集。

2結(jié)果與分析

2.1多態(tài)性InDel引物篩選與初選多樣性固定群體的遺傳多樣性分析經(jīng)過引物篩選，獲得在不同材料間有多態(tài)性的149對InDel引物，這些引物在473個自交系中均擴增出具有明顯多態(tài)性且?guī)头€(wěn)定的產(chǎn)物，通過條帶統(tǒng)計共檢測到310個等位位點，每對InDel引物在所有材料中擴增出2～3個等位位點，平均等位基因數(shù)為2.1074個。各引物揭示的所有材料的有效等位基因數(shù)分布在1.0043～2.7587之間，平均為1.7930;Shannon's信息指數(shù)范圍為0.0154～1.0537，平均值為0.6182;基因多樣性變幅為0.0043～0.6375，平均為0.4230;多態(tài)性信息含量為0.0043～0.5629，平均值為0.3310，說明這些引物能很好地檢驗黃瓜種質(zhì)資源的遺傳多樣性。

2.2多樣性固定核心樣本集的構(gòu)建

2.2.1分組隨機取樣法構(gòu)建核心樣本集對黃瓜初級遺傳多樣性固定群體按5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的比例分別進行分組隨機取樣，計算不同比例構(gòu)成的候選多樣性固定核心樣本集和初級遺傳多樣性固定群體(100%)的平均等位基因數(shù)、總等位位點數(shù)、等位位點保留百分率(表4)，有效等位基因數(shù)、Shannon's指數(shù)、基因多樣性、PIC多態(tài)性信息含量。如表4和圖1所示，隨取樣比例的增加，各指標均呈不規(guī)律上升趨勢，且上述各參數(shù)在取樣比例為15%時出現(xiàn)第1次拐點，說明從5%升高到15%的比例時群體多樣性快速增加;當取樣比例達到50%或60%時則達到最高，且高于或接近原始群體。同時，分析顯示，從50%的抽樣比例開始，所獲得的候選核心樣本集的等位位點保留百分率就已達到99.68%，說明50%比例已經(jīng)能很好地表現(xiàn)原始群體的多態(tài)性;比例過低，等位位點丟失嚴重;過高，樣本集的冗余度提高。綜合分析認為50%是分組隨機取樣法構(gòu)建黃瓜多樣性固定核心樣本集的最佳取樣比例。

2.2.2分組聚類+稀有基因優(yōu)選取樣法按照分組聚類和稀有基因優(yōu)選的原則，按各比例取樣最終獲得12個候選核心樣本集，計算不同比例構(gòu)成的候選多樣性固定核心樣本集和初級遺傳多樣性固定群體(100%)的平均等位基因數(shù)、總等位位點數(shù)、等位位點保留百分率(表5)，有效等位基因數(shù)、Shannon's指數(shù)、基因多樣性、PIC多樣性信息含量。如表5和圖2所示，各參數(shù)在取樣比例達到40%開始快速上升，在70%時達到最高，之后趨緩。在5%～15%的區(qū)段，有效等位基因數(shù)和基因多樣性指數(shù)曲線是較低且平緩的，而Shannon's指數(shù)和多態(tài)性信息指數(shù)出現(xiàn)一個小峰值，說明從5%比例升高到10%比例時群體多樣性在增加。從等位位點保留百分率情況看，20%以上的抽樣比例便能使其保留100%，說明在抽樣比例為25%以上時群體內(nèi)出現(xiàn)嚴重冗余。綜合多個參數(shù)的結(jié)果認為，抽樣比例為60%時，不僅候選核心樣本集的等位位點保留比例高、冗余程度低，而且多樣性高于或接近原始群體，是分組聚類+稀有基因優(yōu)先取樣法構(gòu)建候選黃瓜核心樣本集的較佳取樣比例。

2.2.3逐級聚類+稀有基因優(yōu)先取樣法通過逐級聚類分析和取樣，分別得到按90%～5%的12個比例抽樣的候選多樣性固定核心樣本集426份、378份、330份、282份、237份、189份、141份、116份、95份、71份、47份和24份。計算不同比例構(gòu)成的候選多樣性固定核心樣本集和初級遺傳多樣性固定群體(100%)的平均等位基因數(shù)、總等位位點數(shù)、等位位點保留百分率(表6)，有效等位基因數(shù)、Shannon's指數(shù)、基因多樣性、PIC多態(tài)性信息含量。如表6和圖3所示，隨取樣比例的增加呈先逐漸下降后又逐漸上升的變化趨勢。當取樣比例在5%～15%時，各參數(shù)值處于高位。在取樣比例為30%時，各參數(shù)的下降速度出現(xiàn)拐點，且與90%取樣比例的各參數(shù)接近。當取樣比例為60%～70%時，各指標處于低谷。同時，抽樣比例在15%時，候選核心樣本集的等位位點保留百分率達到99.68%，在20%比例及以上時，等位位點保留百分率達到100%，說明從25%比例開始群體內(nèi)出現(xiàn)冗余。綜合比較各參數(shù)，認為15%是逐級聚類+稀有基因優(yōu)先取樣法構(gòu)建候選黃瓜核心樣本集的最佳取樣比例，它既能很好地保留等位基因位點，同時也能較好地保持原有群體的遺傳多樣性。

2.3候選多樣性固定核心樣本集的評價確定了3種取樣方法的最佳取樣比例，分別構(gòu)建3個最優(yōu)候選多樣性固定核心樣本集，即按照分組隨機取樣法的50%比例構(gòu)建的候選核心樣本集被標記為Core1，按照分組聚類+稀有基因優(yōu)選取樣法的60%比例構(gòu)建的候選核心樣本集被標記為Core2，按照逐級聚類+稀有基因優(yōu)先取樣法的15%比例構(gòu)建的候選核心樣本集被標記為Core3。比較3個候選核心樣本集的平均等位基因數(shù)、總等位位點數(shù)、等位位點保留百分率、平均有效等位基因數(shù)、Shannon's指數(shù)、基因多樣性、多態(tài)性信息指數(shù)。從表7中可以看出，3個核心樣本集與原始群體的各項參數(shù)經(jīng)t檢驗表現(xiàn)為不顯著，即3個候選樣本集均可以視為有效的核心樣本集。比較而言，逐級聚類+稀有基因優(yōu)先取樣法構(gòu)建的Core3的平均有效等位基因數(shù)、Shannon's指數(shù)、基因多態(tài)性和PIC值均高于或接近原始群體，同時保留了99.68%的原始群體的等位位點，表現(xiàn)了較好的去冗余的作用。最終確定以逐級聚類+稀有基因優(yōu)先取樣法的15%比例構(gòu)建的候選核心樣本集Core3作為黃瓜多樣性固定核心樣本集。構(gòu)建的多樣性固定核心樣本集包括71份種質(zhì)(表8)，這些材料分別來自中國東北、華北、華中、華東、華南、西北、西南等7個地區(qū)的18個省市，其中，來自黑龍江1份、吉林4份、遼寧1份、河北2份、內(nèi)蒙古1份、河南2份、湖北6份、湖南1份、安徽1份、江蘇1份、山東2份、廣東3份、臺灣1份、寧夏1份、新疆1份、廣西1份、四川3份、云南6份。國外資源分別來自15個國家，其中來自捷克1份、法國1份、伊朗1份、荷蘭1份、波蘭1份、波多黎各1份、西班牙1份、贊比亞1份、津巴布韋1份、俄羅斯3份、美國4份、日本3份、敘利亞1份、以色列1份、印度7份。另外還有5份材料來源未知。可見，多樣性固定核心樣本集的材料來源地覆蓋面廣，具有豐富的多樣性和代表性。

3討論

不同作物由于授粉特性不同而導致同一種質(zhì)內(nèi)的雜合性不同，自花授粉種質(zhì)雜合度較低而異花授粉種質(zhì)的異質(zhì)性較高。對于異花授粉的黃瓜來講，純合度低必將影響種質(zhì)資源研究利用的效度，所以本研究利用黃瓜表型核心種質(zhì)的自交系構(gòu)建多樣性固定核心樣本集不失為提高異化授粉作物種質(zhì)資源研究和利用效率的一種較好的選擇。

核心種質(zhì)是以最少的種質(zhì)資源樣品來最大程度地代表一個物種種質(zhì)資源的遺傳多樣性［28-29］。核心種質(zhì)的構(gòu)建方法很多［30-31］，王麗俠等［32］認為類內(nèi)隨機取樣法構(gòu)建的核心種質(zhì)表現(xiàn)最佳;姜慧芳等［33］采用分層聚類以及隨機取樣結(jié)合必選資源的方法，有效構(gòu)建了花生核心種質(zhì);李國強［34］按照大白菜分類系統(tǒng)和結(jié)球大白菜生態(tài)型采用分組聚類法構(gòu)建出284份大白菜核心種質(zhì);郝晨陽等［35］采用適當調(diào)整的分層分組代表性取樣法構(gòu)建我國普通小麥核心種質(zhì)，對著名品種、重要育種親本和攜帶稀有等位變異基因等材料優(yōu)先入選，即對遺傳多樣性高的地區(qū)增加取樣量，反之減少;吳子龍等［36］和崔娜［37］采用有分子標記結(jié)合逐步壓縮聚類法分別構(gòu)建了山葡萄核心種質(zhì)和蘿卜核心種質(zhì)。本研究采用3種取樣方法構(gòu)建候選核心樣本集，最終認為逐級聚類+稀有基因優(yōu)先取樣法按15%比例取樣構(gòu)建的黃瓜多樣性固定核心樣本集最優(yōu)，逐級聚類+稀有基因優(yōu)先取樣法在盡量保留具有稀有基因樣品的同時，在整體上利用種質(zhì)親緣關(guān)系遠近來去除冗余是行之有效的。

本研究構(gòu)建的核心種質(zhì)與呂婧［14］采用M策略從3318份原始黃瓜種質(zhì)資源中篩選出120份黃瓜核心種質(zhì)相比較的最大特點在于:InDel標記的應(yīng)用主要反映的是黃瓜基因組插入和缺失變異信息;試驗材料并非是隨意獲取的雜合度高低不一的原始種質(zhì)，而是通過對種質(zhì)庫保存的資源的表型鑒定構(gòu)建初級核心種質(zhì)，再經(jīng)過多代純化形成遺傳多樣性豐富和遺傳穩(wěn)定的自交系;分子微核心種質(zhì)對表型核心種質(zhì)的代表性達到99%以上，更利于核心種質(zhì)在科研和育種中的直接利用。構(gòu)建核心種質(zhì)所用的數(shù)據(jù)也有很多類型，如表型性狀數(shù)據(jù)(如質(zhì)量性狀［34，38-39］或數(shù)量性狀［34，39-40］)，分子數(shù)據(jù)(AFLP引物［41-43］，SSR引物［14，32，35，44-45］，EST-SSR引物［37，46］，RAPD引物［47-48］，InDel引物［15］)和表型數(shù)據(jù)結(jié)合分子數(shù)據(jù)［49］等，不同類型的數(shù)據(jù)會從不同的方面反映出種質(zhì)資源的背景、特征和遺傳多樣性。本研究利用InDel分子標記數(shù)據(jù)結(jié)合種質(zhì)材料來源地對黃瓜核心種質(zhì)自交系進行分析并構(gòu)建多樣性固定核心樣本集，其所反映的遺傳信息不同于呂婧［14］用SSR構(gòu)建的核心種質(zhì)。本研究中由單一標記獲得的較少的數(shù)據(jù)類型可能會影響多樣性固定核心樣本集特征的全面反映，將來有必要綜合利用不同類型的分子和表型鑒定數(shù)據(jù)對多樣性固定核心樣本集進行完善。

作者：張微 李斯更 沈鏑 李錫香 單位：中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所/農(nóng)業(yè)部蔬菜作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制北京科學觀測實驗站