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作者：劉長(zhǎng)發(fā)姚敬元袁瑗劉衛(wèi)東單位：近岸海洋環(huán)境科學(xué)與技術(shù)遼寧省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室大連海洋大學(xué)大連海洋大學(xué)海洋科技與環(huán)境學(xué)院遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院

材料與方法

1材料

氨氧化細(xì)菌樣品采自實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的封閉循環(huán)海水養(yǎng)殖系統(tǒng)中填充塑料環(huán)載體的硝化作用濾器。采樣前14d測(cè)得的硝化作用濾器的性能指標(biāo)見(jiàn)表1。

2基因組RNA的提取

將適量附有生物膜的載體置于盛有150mL滅菌海水的250mL燒杯中，用磁力攪拌器攪拌。20min后采用2種方法濃縮菌體:一是過(guò)濾，用0．45μm微孔濾膜過(guò)濾、蒸餾水沖洗后置于－20℃?zhèn)溆?二是離心(HERMLZ323K，德國(guó))，4℃下12000r/min離心5min，收集離心沉淀物備用。RNA提取采用經(jīng)典方法的改進(jìn)方法。于收集的菌體中加入6μL20mg/mL蛋白酶K、2μL0．2%β-巰基乙醇、0．6mL2%CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)，55℃溫育1h后消化，再加入酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1)混合液，完全混勻后，12000r/min離心5min。取上清于一潔凈離心管中，再加入氯仿-異戊醇(24∶1)混合液混勻后12000r/min離心5min。再取上清于潔凈離心管中，加入雙倍量的無(wú)水乙醇，混勻后置于－20℃下20min。高速離心產(chǎn)物以70%乙醇洗2遍之后風(fēng)干。加入適量TE后置于－20℃保存待用。

3相關(guān)基因的PCR擴(kuò)增

以提取的基因組RNA作為PCR反應(yīng)模板，采用巢式擴(kuò)增法對(duì)氨氧化細(xì)菌16SrRNA基因及氨單加氧酶基因amoA進(jìn)行PCR擴(kuò)增(Eppen-dorfS，德國(guó))。具體方法是:先采用細(xì)菌16SrRNA基因通用引物11f和1492r(表2)進(jìn)行大量擴(kuò)增，之后再以特異性引物Nso1225和通用引物［18］EUB338對(duì)β-亞類氨氧化細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增;還采用氨氧化細(xì)菌amoA基因特異性引物AmoA-1F和AmoA-2R對(duì)通用引物的PCR產(chǎn)物進(jìn)行二次擴(kuò)增。

4酶切連接

16SrRNA基因擴(kuò)增片段的限制性酶切體系為2μLPCR產(chǎn)物，1μL緩沖液，1μL0．1%BSA及0．5μLTaqI內(nèi)切酶，在65℃下溫育4h進(jìn)行酶切;amoA的限制性酶切體系為2μLPCR產(chǎn)物、1μL緩沖液、1μL0．1%BSA及0．5μLMspI內(nèi)切酶，在37℃溫育3h進(jìn)行酶切。酶切后以接頭引物在22℃下連接6h。在之后的PCR反應(yīng)中，以接頭引物與相應(yīng)的RNA一端引物配對(duì)，使之只能擴(kuò)增出一端的末端片段。

5溶膠液PCR

將1．4節(jié)中的PCR產(chǎn)物進(jìn)行4．5%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后膠板在空氣中干燥約1h，用潔凈的小刀將產(chǎn)物帶割下，溶于純凈水1h，以6μL溶液作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。16SrRNA的引物為接頭引物(TaqI)和末端引物(Nso1225或Eub338f)雙引物;氨氧化細(xì)菌amoA引物接頭引物(MspI)和末端引物(AmoA-1F或AmoA-2R)雙引物。

6克隆測(cè)序、序列對(duì)比分析與系統(tǒng)發(fā)育分析

將得到的末端片段PCR產(chǎn)物送交寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行克隆測(cè)序。測(cè)得序列在GenBank中進(jìn)行BLAST(blast．ncbi．nlm．nih．gov/)搜索，尋同源已知菌，并采用ClustalX及MEGA3軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

結(jié)果

1PCR片斷酶切及擴(kuò)增產(chǎn)物

圖1為氨氧化細(xì)菌16SrRNA酶切片段及PCR產(chǎn)物電泳圖。其中，左側(cè)泳道為100bpRNAladderMarker，1、2泳道為酶切片段，為使酶切片段能更清晰的在電泳圖上表現(xiàn)出來(lái)，采取了增加模板量的方法，雖然可能一些模板不被切開，但在連接液中使用的酶切液含模板較少，未切開的模版對(duì)結(jié)果影響很小。3、4、5泳道為引物TaqI+Nso1225的PCR產(chǎn)物，在10μL反應(yīng)液中的模板濃度分別為0．125μL、0．25μL、0．5μL，結(jié)果是條帶單一且均很亮;6、7、8泳道為引物TaqI+EUB338的組合PCR產(chǎn)物，在10μL反應(yīng)液中的圖1氨氧化細(xì)菌16SrRNA酶切片段及擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig．1GelosegelprofileofAOB16SrRNAgenesequencesandPCR-amplifiedproducts模板濃度分別為0．125μL、0．25μL、0．5μL。由圖1，引物TaqI+EUB338組合的PCR產(chǎn)物有多個(gè)清晰的條帶，多態(tài)性明顯高于引物TaqI+Nso1225的PCR產(chǎn)物?？蛇x擇引物TaqI+EUB338組合的PCR產(chǎn)物作為割膠擴(kuò)增的模板。

2溶膠液PCR產(chǎn)物電泳

圖2為引物TaqI+EUB338組合的氨氧化細(xì)菌16SrRNA正向末端酶切片段溶膠液PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。圖中左側(cè)泳道為100bpRNAladderMarker，奇數(shù)道為僅使用雙倍量TaqI接頭引物(0．4μL/10μL)的單引物即擴(kuò)增產(chǎn)物，偶數(shù)道為使用TaqI接頭引物(0．2μL/10μL)+EUB338組合引物的擴(kuò)增產(chǎn)物。由圖2可見(jiàn)，奇數(shù)道無(wú)條帶，表明在單引物實(shí)驗(yàn)體系中無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，偶數(shù)道即在雙引物實(shí)驗(yàn)體系中有擴(kuò)增產(chǎn)物，且條帶清晰、無(wú)拖尾，片段長(zhǎng)度不同均在300bp以下，可用于基因克隆測(cè)序。圖3為氨氧化細(xì)菌amoA正向末端酶切片段溶膠液PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。圖中左側(cè)泳道為100bpRNAladderMarker，其它泳道為amoA基因條帶，均集中于100～200bp，長(zhǎng)度接近，清晰無(wú)拖尾，PCR效果良好，可用于基因克隆測(cè)序。

3基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

對(duì)氨氧化細(xì)菌16SrRNA和amoA基因正向末端酶切片段溶膠液PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，共測(cè)得11條序列，其長(zhǎng)度分布于200～300bp，16SrRNA基因序列的Blast分析結(jié)果見(jiàn)表3所示，amoA基因序列Blast分析結(jié)果見(jiàn)表4所示。序列11-8、11-8-1-2、11-8-2-2及序列10-6-1與亞硝化單胞菌群中Nitrosomonasoligotropha(EF016119、AJ298736)的相似度≥99%，可確定為同一屬;序列35、36、37及11-8-7-2與亞硝化單胞菌屬Nitrosomonassp．(AF386746、M96400、AY123811、DQ002459)的相似度為95%以上;序列2與Nitrosomonasaestuarii(AF272420)、序列4-26-1-4-1與Nitrosomonasmarina(AF272418)的相似度分別為100%，基本確定為同一種，屬于亞硝化單胞菌群。僅有與Nitrosospiratenuis(AJ298746)的相似度為100%的序列10-6-3屬于亞硝化螺菌屬。由此可推斷，在循環(huán)海水養(yǎng)殖系統(tǒng)硝化作用濾器氨氧化細(xì)菌中亞硝化單胞菌群占主體，存在少量的亞硝化螺菌群。圖4為氨氧化細(xì)菌16SrRNA序列同源性分析圖。由表4，對(duì)氨氧化細(xì)菌amoA正向末端酶切片段溶膠液PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，只測(cè)得3條序列，其長(zhǎng)度在200～300bp。序列11-8-12、11-8-13與Nitrosomonassp．(AF386746、AF339041)相似度分別為87%和92%;序列9-26-4-1-2與Nitro-somonascryotolerans(AF314753)的相似度為87%。

相似度都不高，均屬于亞硝化單胞菌群。由于測(cè)得的序列信息量相對(duì)較少，故未作聚類分析。

討論

硝化作用過(guò)程一般包括兩個(gè)轉(zhuǎn)化步驟，第一步是氨氧化為亞硝酸(NH+4→NO－2)，第二步是亞硝酸氧化為硝酸(NO－2→NO－3)，其中第一步是限制性步驟。該步驟對(duì)氨氮轉(zhuǎn)化為硝酸氮即對(duì)氨氮的去除有著很大影響。因此，分析循環(huán)海水養(yǎng)殖系統(tǒng)硝化作用濾器載體上附著的氨氧化微生物，對(duì)于明確硝化作用濾器的掛膜及生物膜對(duì)氨氮的去除有重要意義。

基于16SrRNA基因序列同源性系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，氨氧化細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育較單一，均屬于變形菌門(Proteobacteria)的β-變形菌綱和γ-變形菌綱。其中β-變形菌綱又分為2個(gè)類群:亞硝化單胞菌(Nitrosomonas)和亞硝化螺菌(Nitrosospi-ra)。基于16SrRNA的AFLP技術(shù)中使用巢式PCR在分析亞硝化單胞菌上具有高度的靈敏性和有效性。本實(shí)驗(yàn)采用氨氧化細(xì)菌16SrRNA基因特異PCR結(jié)合改良的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)方法，所測(cè)得的11條序列經(jīng)Blast分析，大部分序列與亞硝化單胞菌群Nitrosomonasoligo-tropha、Nitrosomonasmarina及Nitrosomonasaesturii等序列相似度高，推斷在生物濾器中有大量亞硝化單胞菌群存在;也有少數(shù)序列(10-6-3)與亞硝化螺菌群序列相似度高，推斷在生物濾器中可能存在少量的亞硝化螺菌;還有一些序列經(jīng)Blast分析發(fā)現(xiàn)其與埃希式桿菌屬(GQ149348)具有一定的相似性，表明該硝化作用濾器中還可能存在一定數(shù)量的γ-變形菌綱細(xì)菌。本次并未檢測(cè)到亞硝化葉菌屬、亞硝化球菌屬及亞硝化弧菌屬的類似菌，還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

采用氨單加氧酶功能基因定性分析氨氧化細(xì)菌的分子生物學(xué)方法主要是分析amoA、amoB和amoC亞基組成的基因產(chǎn)物，其中amoA基因的定性分析可以反映出氨氧化細(xì)菌的種類、數(shù)量和活性。對(duì)氨氧化細(xì)菌的研究表明，鹽分可以明顯影響氨氧化細(xì)菌的多樣性，河口區(qū)域氨氧化細(xì)菌多樣性的減少與鹽度升高相關(guān)，認(rèn)為鹽度是氨氧化細(xì)菌多樣性和分布的環(huán)境控制因子，高鹽區(qū)域的氨氧化細(xì)菌大多數(shù)類似于亞硝化螺菌屬(Ni-trosospira)，而在中低鹽度區(qū)域則分布著類亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)序列的氨氧化細(xì)菌，以及與Nitrosomonasureae、Nitrosomonasoligotropha和Ni-trosomonassp．Nm143相關(guān)序列的氨氧化細(xì)菌。采用氨氧化細(xì)菌amoA基因分析循環(huán)海水養(yǎng)殖系統(tǒng)硝化作用濾器載體上的氨氧化細(xì)菌得到的信息量相對(duì)較少。采用不同的16SrRNA基因序列引物和不同的PCR及電泳方法可能擴(kuò)增出不同類群的微生物，因此在選擇特異性擴(kuò)增引物及PCR、電泳方法時(shí)，要兼顧擴(kuò)增效率和擴(kuò)增多樣性兩個(gè)方面。

如采用PCR-DGGE方法分析循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)生物濾池中的細(xì)菌主要由擬桿菌門的黃桿菌綱和變形菌門的α-、β-、γ-變形菌綱的15種細(xì)菌組成，并且，初始氨氮越高的濾池中，亞硝化單胞菌屬的細(xì)菌在生物膜上所占比例越高。Nso1225探針對(duì)β-變形菌綱氨氧化細(xì)菌具有高度特異性。

CTO189f/CTO654r引物擴(kuò)增到的β-變形菌綱氨氧化細(xì)菌均屬于Nitrosospira，但CTO189f/CTO654r引物難以擴(kuò)增到Nitrosomonasoligotropha和Nitrosomonascommunis。鑒于不同引物對(duì)β-變形菌綱氨氧化細(xì)菌的擴(kuò)增效率不同，可采用多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增目的基因，則可能得到更加全面的β-變形菌綱氨氧化細(xì)菌多樣性結(jié)果。鹽分可以明顯影響氨氧化細(xì)菌的多樣性，高鹽度環(huán)境下，氨氧化細(xì)菌的多樣性明顯減少，但其數(shù)量明顯增加。pH值也是影響氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的一個(gè)主要因素，pH不同，優(yōu)勢(shì)菌群也會(huì)不同。