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轉(zhuǎn)基因植株的篩選鑒定是植物轉(zhuǎn)基因研究的重要環(huán)節(jié)。目前，轉(zhuǎn)基因棉花篩選鑒定的常用方法為卡那霉素篩選法和PCR分子檢測(cè)法［1－2］。針對(duì)不同試驗(yàn)?zāi)康模@兩種方法相關(guān)報(bào)道的文獻(xiàn)較多，但都有較強(qiáng)的針對(duì)性，在實(shí)際轉(zhuǎn)基因棉花育種過程中，這兩種方法的應(yīng)用均存在弊端。卡那霉素篩選法不能反映目的基因的表達(dá)效果，其篩選結(jié)果缺乏可靠性。PCR分子檢測(cè)法對(duì)試驗(yàn)室要求嚴(yán)格，檢測(cè)費(fèi)用昂貴，檢測(cè)周期長。此外，轉(zhuǎn)基因克隆研究的發(fā)展迅速，不斷出現(xiàn)新的抗蟲基因、抗旱基因、抗病基因［3］，通過外源目的基因表達(dá)，而進(jìn)行生物測(cè)定的篩選方法各不相同，過程復(fù)雜，篩選緩慢。特別是近年，隨著大規(guī)模轉(zhuǎn)基因研究的相繼開展，傳統(tǒng)的篩選方法已無法滿足大規(guī)模轉(zhuǎn)基因后代的高效篩選，尤其是在轉(zhuǎn)基因雜交育種中，需要在開花前得到準(zhǔn)確篩選結(jié)果，以便育種操作，傳統(tǒng)的篩選方法在效率上尚略顯不足。因此，探索一種快速，準(zhǔn)確、較為系統(tǒng)的篩選方法，進(jìn)行大規(guī)模轉(zhuǎn)基因棉花后代群體的篩選顯得尤為重要。本試驗(yàn)結(jié)合我國棉花轉(zhuǎn)基因育種中的兩個(gè)主流方法［4－5］，以花粉管導(dǎo)入［6］外源基因自交系T1－T3、轉(zhuǎn)基因雜交育種F1種子為材料，探討田間卡那霉素篩選與PCR分子鑒定相結(jié)合，應(yīng)對(duì)大規(guī)模轉(zhuǎn)基因棉花后代篩選的可靠性和實(shí)用性，為轉(zhuǎn)基因棉花后代的篩選鑒定提供參考。

1材料與方法

1．1材料供試品種為綠色棉隴綠棉3號(hào)、白色棉隴棉2號(hào)、棕色棉BC05，均由甘肅省農(nóng)科院作物所棉花研究室選育、提供，具有纖維品質(zhì)優(yōu)良、產(chǎn)量穩(wěn)定等突出性狀［7－8］。轉(zhuǎn)基因鑒定的供試材料為：①通過花粉管通道法對(duì)隴綠棉3號(hào)、BC05導(dǎo)入抗蟲基因GNA、抗旱基因GhABF2的T1－T3；②WBK09、20090713－1979分別與隴綠棉3號(hào)、BC05、隴棉2號(hào)雜交F1（GNA、GhABF2的基因質(zhì)粒、引物序列由中國農(nóng)科院生物技術(shù)研究所提供；WBK09含Bt抗蟲基因，材料和引物序列均由中國農(nóng)科院生物技術(shù)研究所提供；20090713－1979含BADH抗旱基因，材料和引物序列由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供），花粉管導(dǎo)入T1－T3材料為海南、敦煌兩地繁育所得，WBK09、20090713－1979與供試品種雜交F1由海南育種所得。GNA、GhABF2的基因質(zhì)粒與WBK09、20090713－1979均攜帶NPTⅡ標(biāo)記基因（新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因），該基因是目前基因工程中被廣泛使用的選擇標(biāo)記，它對(duì)植物細(xì)胞表現(xiàn)毒性的機(jī)理是：卡那霉素干擾了細(xì)胞葉綠體及線粒體的蛋白質(zhì)合成，最終導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡，而轉(zhuǎn)基因植株抑制了這個(gè)過程［9－10］。供試材料種植于甘肅省敦煌市肅州鎮(zhèn)隔離試驗(yàn)區(qū)。分子鑒定地點(diǎn)為甘肅省農(nóng)科院生物技術(shù)研究所基因工程研究室。

1．2方法

1．2．1卡那霉素濃度梯度試驗(yàn)。設(shè)置卡那霉素3．0g•L－1、5．0g•L－1、7．0g•L－1三個(gè)處理濃度，在棉花現(xiàn)蕾期，對(duì)供試品種頂端倒數(shù)第2片真葉用毛筆涂抹藥液，各處理50株，以WBK09做對(duì)照（經(jīng)過PCR分子檢測(cè)，攜帶NPTⅡ標(biāo)記基因），3～5d觀察統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1．2．2卡那霉素抗性植株篩選。在卡那霉素濃度梯度試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)轉(zhuǎn)基因供試材料進(jìn)行卡那霉素篩選，對(duì)篩選后的陽性植株做標(biāo)記，以備PCR分子檢測(cè)。

1．2．3PCR分子檢測(cè)。剪取陽性植株頂端較嫩葉片，采用改良的CTAB大量提取法［11］提取純化基因組DNA，針對(duì)陽性植株所含不同基因，利用設(shè)計(jì)好的引物（表1）進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR體系所用藥劑為Fermentas公司生產(chǎn)，采用引物由Invitrogen公司合成，統(tǒng)計(jì)檢測(cè)結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2．1不同品種敏感性及卡那霉素篩選條件的確定根據(jù)田間觀察結(jié)果，對(duì)棉葉與卡那霉素處理反應(yīng)的表現(xiàn)分為三個(gè)等級(jí)，Ⅰ級(jí)：涂抹葉片正常；Ⅱ級(jí)：涂抹葉片有輕微變黃；Ⅲ級(jí)：涂抹葉片具有黃色斑點(diǎn)（圖1），為了得到可靠的卡那霉素篩選結(jié)果，消除棉花葉片自身對(duì)卡那霉素具有抗性的試驗(yàn)影響，以Ⅲ級(jí)處理結(jié)果作為卡那霉素篩選標(biāo)準(zhǔn)。在該篩選標(biāo)準(zhǔn)下，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明：三種濃度的卡那霉素棉葉涂抹，3～5d內(nèi)，均使隴棉2號(hào)、隴綠棉3號(hào)、BC05的棉葉百分之百轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂悬S色斑點(diǎn)的葉片；對(duì)照WBK09經(jīng)過濃度為7．0g•L－1卡那霉素棉葉涂抹，在3～5d內(nèi)，葉片仍未變化。該結(jié)果表明，3．0～7．0g•L－1卡那霉素葉片涂抹，可以明顯區(qū)分轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因植株。此外，參試品種在5．0g•L－1卡那霉素葉片涂抹處理下，百分之百轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂悬S色斑點(diǎn)葉片，隴棉2號(hào)需要3d，BC05需要4d，而隴綠棉3號(hào)需要5d；因此，可以認(rèn)為，隴棉2號(hào)棉葉對(duì)卡那霉素最為敏感，BC05次之，隴綠棉3號(hào)棉葉與卡那霉素反應(yīng)最為遲緩。在保證準(zhǔn)確性的前提下，為了快速得到篩選結(jié)果，可以確定隴棉2號(hào)的最佳篩選條件為5．0g•L－1卡那霉素葉片涂抹，0～3d觀察期；BC05的最佳篩選條件為5．0g•L－1卡那霉素葉片涂抹，0～4d觀察期；隴綠棉3號(hào)的最佳篩選條件為3．0g•L－1卡那霉素葉片涂抹，0～5d觀察期（見表2）。

2．2卡那霉素篩選結(jié)果分析在確定卡那霉素篩選最佳條件后，以各品種最佳篩選條件對(duì)相關(guān)轉(zhuǎn)基因后代進(jìn)行田間篩選操作，0～5d內(nèi)，共計(jì)篩選出820份葉片未變色的植株，其中，隴棉2號(hào)181株，隴綠棉3號(hào)324株，BC05315株。隴棉2號(hào)、隴綠棉3號(hào)、BC05在篩選過程中得到穩(wěn)定篩選結(jié)果的時(shí)間分別為第3d，第4d，第5d（表3），該結(jié)果表明，針對(duì)不同品種確定的最佳篩選條件具有一定的可靠性。由于操作簡(jiǎn)單，本次試驗(yàn)僅用5d完成21112份轉(zhuǎn)基因棉花后代材料的田間篩選，因此，可以認(rèn)為，田間卡那霉素篩選可以快速、準(zhǔn)確地篩選出具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)基因植株。

2．3PCR分子檢測(cè)結(jié)果分析對(duì)820份陽性植株，進(jìn)一步進(jìn)行PCR分子檢測(cè)，得到具備NPTⅡ標(biāo)記基因的材料806份，攜帶目的基因的材料有161份，其中轉(zhuǎn)基因雜交育種F1中，有158份含有目的基因；通過花粉管導(dǎo)入基因的T1－T3材料中，雖然有269份材料驗(yàn)證出NPTⅡ標(biāo)記基因，但只有3份材料具備目的基因（表4，圖2）；經(jīng)過多次重復(fù)，結(jié)果一致。該結(jié)果表明：卡那霉素陽性植株篩選的準(zhǔn)確率為98．3％，卡那霉素篩選攜帶目的基因的轉(zhuǎn)基因植株準(zhǔn)確率為20％；處于連鎖狀態(tài)的標(biāo)記基因與目的基因，在轉(zhuǎn)基因育種過程中沒有完全轉(zhuǎn)化或遺傳。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過對(duì)隴棉2號(hào)、隴綠棉3號(hào)、BC05非轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行卡那霉素敏感試驗(yàn)，以確定田間卡那霉素篩選的最佳條件，在此試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)其相關(guān)轉(zhuǎn)基因后代進(jìn)行田間卡那霉素初篩，對(duì)篩選后的材料進(jìn)行分子鑒定。試驗(yàn)結(jié)果表明，在實(shí)際轉(zhuǎn)基因棉花育種中，應(yīng)對(duì)大規(guī)模轉(zhuǎn)基因棉花后代篩選鑒定，卡那霉素葉片涂抹與目的基因PCR檢測(cè)相結(jié)合，具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，是一種高效的篩選方法，具備一定的實(shí)用性。在卡那霉素濃度梯度試驗(yàn)中，不同品種的棉葉對(duì)卡那霉素的敏感性不同，與白色棉隴棉2號(hào)相比，綠色棉隴綠棉3號(hào)，棕色棉BC05的葉片小，蠟質(zhì)層較厚，該生理性狀影響葉片與卡那霉素反應(yīng)。王彥霞、燕麗萍、李舉等［12－14］在卡那霉素篩選研究中，使用的卡那霉素篩選濃度也各不相同。因此，不同品種在不同地區(qū)做轉(zhuǎn)基因材料田間篩選，要得到準(zhǔn)確的篩選結(jié)果，必須進(jìn)行前期梯度試驗(yàn)。在PCR分子檢測(cè)試驗(yàn)中，標(biāo)記基因鑒定結(jié)果與目的基因鑒定結(jié)果相差甚遠(yuǎn)，這種情況在通過花粉管導(dǎo)入后代的材料中尤其明顯，祝建波［15］在研究過程中也發(fā)現(xiàn)類似情況，并推測(cè)原因是：在轉(zhuǎn)基因過程中，標(biāo)記基因與目的基因在核酸酶的影響下，形成不完整片段。由于這種原因一般只導(dǎo)致出現(xiàn)個(gè)別異常，在本次試驗(yàn)中，試驗(yàn)群體龐大，不會(huì)造成差異如此懸殊的標(biāo)記基因與目的基因鑒定結(jié)果，所以，在本次試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，推測(cè)原因?yàn)椋禾幱谶B鎖狀態(tài)的標(biāo)記基因和目的基因在轉(zhuǎn)基因過程中存在分離情況。該推測(cè)需要進(jìn)一步試驗(yàn)研究進(jìn)行論證，但試驗(yàn)結(jié)果可以明確，卡那霉素篩選準(zhǔn)確率低，目的基因PCR鑒定才是準(zhǔn)確的篩選方法。在大規(guī)模轉(zhuǎn)基因棉花育種中，快速、準(zhǔn)確的篩選尤為重要。尤其在轉(zhuǎn)基因雜交育種過程中，需要在開花前得到準(zhǔn)確的篩選結(jié)果，以便進(jìn)行親本選配及雜交組合的田間操作，此時(shí)，如果對(duì)轉(zhuǎn)基因育種T0進(jìn)行卡那霉素快速篩選，縮小范圍后，再進(jìn)行準(zhǔn)確的分子鑒定跟蹤，可以大規(guī)模減少后代群體，提高篩選效率，盡早篩選得到含有目的基因的轉(zhuǎn)基因材料，加快其后代進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性、基因表達(dá)量的研究，縮短安全性申報(bào)及產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。