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《安徽農業科學雜志》2014年第二十五期

1方法

1．1供試品溶液制備方法。準確稱取山牡荊粗粉30g，于1000ml燒瓶中，按要求加入提取溶劑，加熱回流提取一定時間，過濾，減壓回收溶劑，干燥，稱重，得山牡荊干膏。精密稱取在不同提取條件下所得山牡荊干膏10mg，于10ml容量瓶中，用60%乙醇溶解，定容后備用。

1．2標準品溶液制備方法。精密稱取于120℃干燥至恒重蘆丁對照品10mg，于100ml容量瓶中，加60%乙醇30ml，水浴微熱使溶，放冷，60%乙醇定容至100ml，制成0．100mg/ml蘆丁對照品溶液。1．3．3標準曲線制備。分別精密吸取蘆丁對照品溶液0、1．00、2．00、3．00、4．00、5．00ml，分別于25ml容量瓶中，各加0．75ml亞硝酸鈉溶液(50mg/ml)，搖勻，靜置7min;再加0．75ml硝酸鋁溶液(100mg/ml)，搖勻，靜置7min;再加10ml氫氧化鈉溶液(40mg/ml)，60%乙醇定容，搖勻，靜置8min。于510nm波長處測吸光度，以吸光度A為縱坐標、蘆丁濃度C為橫坐標，進行線性回歸，計算回歸方程。

1．4精密度試驗。精密吸取2．0ml蘆丁對照液于25ml容量瓶中，按“1．3．3”方法，重復操作5次。

1．5穩定性試驗。取適量供試品溶液，按“1．3．3”方法，于0、2、4、6、8h分別測定吸光度。

1．6重復性試驗。取同一批藥材，按照“1．3．1”方法制備供試品溶液，并按“1．3．3”所述方法測定吸光度，重復5次。

1．7回收率試驗。精密移取6份已知含量供試品溶液各0．5ml，均精密加入蘆丁標準品溶液，按“1．3．3”方法測定其吸光度，計算山牡荊總黃酮含量。

1．8供試品總黃酮含量測定。精密移取5ml供試品溶液，于25ml容量瓶中，按“1．3．3”方法測吸光度，并代入回歸方程，計算總黃酮的含量。

1．9正交試驗。應用正交試驗設計，選擇了乙醇濃度(A)、乙醇用量(B)、提取次數(C)和提取時間(D)作為考察因素，每個因素選擇了3個水平(表1)，以總黃酮含量作為考核指標，按照L9(34)正交設計方案進行試驗。

2結果與分析

2．1山牡荊中總黃酮的含量測定經計算，以吸光度A為縱坐標、蘆丁濃度C為橫坐標的標準曲線的回歸方程為A=12．473C+0．0019(r=0．9996)，表明蘆丁在0．005～0．049mg/ml濃度范圍與其吸光度呈良好線性關系。精密度試驗結果顯示，5次吸光度值的相對標準偏差(RSD)為0．53%，表明該方法有良好精密度。穩定性試驗發現，5次吸光度值的RSD為1．36%，表明在8h內測定供試品基本穩定。重復性試驗中5次吸光度值的RSD為1．73%;回收率試驗得出平均回收率97．59%，RSD=1．55%，表明該方法有良好重現性。

2．2山牡荊總黃酮提取工藝優化

2．2．1正交試驗。極差分析表明(表2)，影響山牡荊總黃酮的提取主次因素依次為B＞A＞C＞D，即乙醇用量＞乙醇濃度＞提取次數＞提取時間;方差分析(表3)顯示，乙醇濃度、乙醇用量對結果影響具有極顯著性的意義，提取次數對試驗結果影響有顯著意義。正交設計結果(表2)顯示，提取工藝A1B2C3D2為最佳，但D因素影響小，且3個水平相差不大，為了節省能源，選用D1。因此，最佳工藝確定為70%乙醇12倍量加熱回流提取3次，每次1h。

2．2．2工藝驗證試驗。采用篩選后得到的最佳工藝，即A1B2C3D1提取3次，進行了驗證試驗，按“1．3．3”方法測吸光度，計算總黃酮的含量。結果發現，3批山牡荊總黃酮的含量分別為40．32、39．02、39．56mg/g，相對標準偏差RSD=1．65%(n=3)，表明該工藝路線是穩定可靠的。

3結論

筆者曾進行了山牡荊藥材粒度、提取時間、乙醇用量、乙醇濃度、提取次數單因素的篩選試驗，結果顯示山牡荊粒度對提取效率的影響不大，因此選擇對提取效率有較大影響的乙醇濃度、提取時間、提取次數、乙醇用量為考察因素，進行正交試驗，優選其最佳提取工藝條件。經正交設計結果分析及方差分析，發現影響山牡荊總黃酮提取主次因素依次為乙醇用量＞乙醇濃度＞提取次數＞提取時間，經綜合各種因素后，選定A1B2C3D1為山牡荊總黃酮的最佳提取方案，即70%濃度12倍量乙醇經加熱回流提取3次，每次1h，按此條件提取，總黃酮含量較高。并按照最佳提取條件進行了驗證試驗，結果表明該提取工藝方法簡單、高效、穩定。

作者：代現平班翠紅韓景田單位：濱州醫學院藥學院