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《安徽農業科學雜志》2014年第二十五期

1蕓香草中多酚的抗氧化活性的測定

1．1還原力的測定［8］。移取濃度為0．5mg/ml的蕓香草不同極性提取液0．4ml，稀釋至1．0ml，加2．5ml磷酸鹽緩沖液PBS(0．2mol/L，pH6．6)搖均，再加入1%鐵氰化鉀2．5ml搖均，置于50℃水浴恒溫反應20min，加10%三氯乙酸溶液1ml，搖均，3000r/min離心5min;取上清液2．5ml，加水2．5ml稀釋，再加入0．1%三氯化鐵0．5ml，避光反應10min后在波長760nm處測定吸光度。每個樣重復測定3次，取平均值。同時在相同條件下測定抗壞血酸(VC)的還原力。

1．2DPPH•自由基清除能力的測定［9］。移取適當濃度的蕓香草不同極性提取液各2．0ml于具塞試管中，加入0．010mg/ml的DPPH•乙醇溶液2．0ml，混合均勻，靜置30min后倒入1cm的比色皿中，在517nm處測定其吸光度值，同時測定樣品空白以及不加樣空白的吸光度值。每個樣重復測定3次，取平均值。同時相同條件下測定抗壞血酸(VC)對DPPH•自由基清除能力。

1．3羥基自由基清除率的測定［10］。向25ml容量瓶中依次加入7．5mmol/ml鄰二氮菲溶液1．0ml、PBS(pH=7．4)5．0ml、7．5mmol/mlFeSO4溶液1．0ml，一定量的抗氧化劑溶液(損傷管及未損傷不加提取液)、體積分數為0．1%雙氧水1．0ml(未損傷管不加)，以蒸餾水定容，暗處放置60min，在510nm處測定吸光度。以上每加一次試劑需搖均。每個樣重復測定3次，取平均值。同時以抗壞血酸(VC)作為對照物。羥自由基清除率計算公式為:羥自由基的清除率。

1．4超氧陰離子自由基的清除率的測定［11］。取50mmol/L的4．5mlTris-HCI緩沖溶液(pH=8．2)，4．2ml蒸餾水混勻后在25℃預熱過的3mmol/L鄰苯三酚0．3ml，迅速搖勻后倒入比測皿，420nm下每隔30s測定吸光度，總4min。以10mmol/LHCI溶液配制空白管作為對照。按照上述步驟在加入鄰苯三酚前先分別加入1．0ml蕓香草不同溶劑提取液，蒸餾水減少。同樣以10mmol/LHCI溶液配制空白管作為對照。同時在相同條件下測定抗壞血酸(VC)對超氧陰離子的清除能力，測定吸光度。超氧陰離子自由基的清除率的測定計算公式為:超氧陰離子自由基的清除率。

2結果與分析

2．1沒食子酸對照品的標準曲線的繪制按“1．3．2．1”項的試驗方法，在760nm波長處測定標準品系列溶液的吸光度，以沒食子酸含量(μg/ml)為橫坐標、相應吸光度為縱坐標進行線性回歸，得到食子酸的標準曲線(圖2)，其回歸方程為y=0．0090x+0．0183(R2=0．9963)。從圖2可看出，在0～84μg/ml有良好的線性關系。

2．2蕓香草不同極性溶劑提取液中多酚含量總多酚含量以Folin-Ciocalteu法測定，結果根據標準曲線計算，所得結果表明，70%乙醇作為溶劑的粗提取液的多酚含量最多，乙酸乙酯相的多酚含量最小，其順序為70%乙醇(3．87mg/g)＞蒸餾水(1．57mg/g)＞正丁醇(0．83mg/g)＞氯仿(0．52mg/g)＞乙酸乙酯(0．41mg/g)，溶劑極性越強，總酚含量越高。根據相似相溶原理可知蕓香草多酚以極性酚為主，極性酚含量顯著高于弱極性酚含量。

2．3蕓香草多酚抗氧化活性的研究

2．3．1蕓香草不同極性提取物的還原力。還原力的測定以樣品是否為電子供體為指標，供應的電子除了可使Fe3+還原為Fe2+外，亦可與自由基反應，使自由基成為較穩定的物質。根據測得的吸光度值可以測定樣品還原能力的大小［12］。吸光度值越大，表明抗氧化劑對Fe3+還原能力越強。從圖3可以看出，蕓香草不同極性提取物均有一定的還原力，在相同濃度下還原力最大的是抗壞血酸(VC)，其次是70%的乙醇提取液，還原力最小的是乙酸乙酯提取液，其還原力相當于VC的1/3。

2．3．2蕓香草不同極性提取物對DPPH•自由基清除能力。DPPH•為一相當穩定的自由基，其甲醇溶液在517nm附近有強的吸光值，當被抗氧化劑還原，或與另外一個自由基結合時，吸光值均會降低，其褪色程度與其接受的電子數量成定量關系［13］。在DPPH•溶液中加入自由基清除劑時，溶液顏色變淺，最大吸收峰處的吸光度變小，而吸光度變小的程度與自由基被清除的程度呈線性關系。因此，可用自由基的清除情況來評價某物的抗氧化能力。其抗氧化能力用清除率表示，清除率越大，抗氧化能力越強。采用“1．3．3．2”節的方法測定不同極性蕓香草多酚對DPPH•自由基的清除作用，結果表明(圖4)，蕓香草不同極性提取液對DPPH•均有一定的清除能力，且均具有明顯的量效關系。提取物中多酚濃度均為0．100mg/ml時，70%乙醇、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水提取液和VC等對DPPH•的清除率分別為95．55%、55．91%、80．80%、81．78%、94．15%和99．72%，70%乙醇和水提取液對DPPH•有較強的清除作用，其清除率與VC的相近。

2．3．3蕓香草不同極性提取物對羥基自由基的清除能力。羥自由基(•OH)是一種氧化能力很強的自由基，它能夠很容易地氧化各種有機物和無機物，氧化效率高，反應速率快，是造成組織脂質過氧化、核酸斷裂、蛋白質和多糖分解的活性氧，與機體的衰老、腫瘤、輻射損傷和細胞吞噬有關。通過Fenton反應所產生的•OH，可使鄰二氮菲—Fe2+水溶液氧化為鄰二氮菲—Fe3+，從而使鄰二氮菲—Fe3+在510nm處的最大吸收峰消失，據此可推知系統中•OH的量的變化［14］。采用Fenton法測定了蕓香草不同極性提取液對•OH的清除作用，結果表明(圖5)，各提取液對•OH均有一定的清除作用，它們的多酚濃度相同(0．100μg/ml)時，各提取液對羥自由基的清除率的大小為VC＞水＞70%乙醇＞正丁醇＞氯仿＞乙酸乙酯。

2．3．4蕓香草不同極性提取物對超氧陰離子自由基的清除能力。鄰苯三酚在堿性條件下發生自氧化釋放氧陰離子自由基(•O－2)，并生成有色中間產物，該有色中間產物在420nm波長處有一特征吸收峰，當有抑制劑存在時，可清除•O－2，從而阻止中間產物的積累，可通過比色法來檢測有色中間產物的含量，以檢測物質清除•O－2的能力［15］。該試驗利用這一特點，測定不同時間反應體系的吸光度，測得鄰苯三酚自氧化速率和加入不同極性提取液后鄰苯三酚自氧化速率，間接測定各提取液對•O－2的抑制率。從圖6可以看出，蕓香草不同極性提取液對超氧陰離子有一定的清除能力，各提取液多酚濃度相同(0．100μg/ml)時，對•O－2清除能力從大到小的順序為70%乙醇＞VC＞水＞正丁醇＞氯仿＞乙酸乙酯，其中70%乙醇對•O－2清除能力與VC相當，而乙酸乙酯提取物對•O－2清除能力是VC的1/4。圖6蕓香草不同極性提取物對•O－2的清除力。

3討論

多酚是植物原料的一種重要次生代謝產物，是絕大多數植物性食品和藥材的活性成分。使用不同極性溶劑可以提取不同極性(即種類)的酚類化合物，它們在結構和性質上有所不同。該試驗用70%乙醇、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水等溶劑超聲提取了蕓香草中多酚，被提取的多酚含量順序為70%乙醇＞水＞正丁醇＞氯仿＞乙酸乙酯。溶劑極性越強，總酚含量越高，根據相似相溶原理可知蕓香草多酚以極性酚為主，極性酚顯著高于弱極性酚含量。蕓香草提取物對DP-PH•自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基的清除率和還原力的大小也與溶劑極性密切相關，總的來說，極性越強的多酚，其抗氧化活性也越強。為了更準確地表征蕓香草抗氧化作用機理，有必要對提取物中多酚單體組分進行分離、純化和結構鑒定。

作者：木妮熱·依布拉音尤努斯江·吐拉洪楊艷梅尚月梅單位：新疆烏魯木齊市疾病預防控制中心新疆大學化學化工學院