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《東北農(nóng)業(yè)科學(xué)雜志》2016年第一期

摘要：

多分DNA病毒（polydnavirus,PDV）是一類共生于膜翅目姬蜂科、繭蜂科和蚜繭蜂科寄生蜂體內(nèi)的昆蟲病毒。在寄生過程中，伴隨著蜂卵的產(chǎn)出，寄生蜂將PDV注入寄主體內(nèi)，通過病毒基因的表達(dá)，破壞寄主的免疫，以保障后代的存活。本文首次在煙蚜繭蜂和蚜蟲模式體系內(nèi)發(fā)現(xiàn)多分dna病毒，初步明確其形態(tài)特征和生理效應(yīng)。

關(guān)鍵詞：

煙蚜繭蜂；多分DNA病毒；形態(tài)特征；生理效應(yīng)

PDV被寄生蜂注射入寄主昆蟲體內(nèi)，能調(diào)節(jié)寄主的生理功能，保證寄生蜂在寄主體內(nèi)的成功發(fā)育[1]。研究表明，在寄生蜂寄生寄主昆蟲過程中，多種調(diào)控因子參與以保證寄生蜂成功寄生[2-4]。其中,多分DNA病毒直接侵染或間接作用于寄主漿細(xì)胞和顆粒細(xì)胞，改變寄主血細(xì)胞行為，抑制寄主的細(xì)胞免疫反應(yīng)，使蜂卵免遭包囊[5-6]。PDV的這種免疫抑制作用方式在不同的系統(tǒng)是不同的。要進(jìn)一步研究PDV對于調(diào)節(jié)寄主免疫及其他生理功能的機(jī)理，對其在寄主組織中的侵染及表達(dá)情況進(jìn)行檢測是必不可少的[7]。筆者實(shí)驗(yàn)室建立煙蚜繭蜂和煙蚜系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)在煙蚜繭蜂雌蜂卵巢內(nèi)亦含有PDV，在寄主體內(nèi)不能復(fù)制但可以進(jìn)行表達(dá)，以原病毒的形式整合在寄生蜂基因組中，并垂直傳播給下一代，雄蜂也能夠通過交配將其所含的病毒基因組傳遞給下一代雌蜂。本文就在煙蚜繭蜂體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)并對PDV進(jìn)行分離提純并進(jìn)行鑒定以及明確其生物學(xué)功能，以期將來進(jìn)行更有效的研究，并揭示其作用機(jī)制。

1試驗(yàn)材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1供試蟲源采用大小為（2×2×4）m3的雙層繁蜂室（實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)）放置50盆（Φ=6～7cm）栽蘿卜，當(dāng)蘿卜長成高于5cm時(shí)接入經(jīng)鑒定的蚜蟲，經(jīng)蚜蟲擴(kuò)繁后，接入煙蚜繭蜂使其擴(kuò)繁；栽植的蘿卜視其生長情況進(jìn)行更換，更換時(shí)將帶蚜葉片取下粘附在新生長的葉片上，當(dāng)蚜量增多時(shí)也可自然轉(zhuǎn)移。每天收集僵蚜1次，置于大型指形管（Φ=2.5cm,h=10cm）中，放于0℃冰箱中備用。

1.1.2煙蚜繭蜂卵巢的獲得待煙蚜繭蜂羽化出蜂后，取200頭雌蜂放于-20℃冰箱中5min使其麻醉，置于滴有1滴無菌生理鹽水的載玻片上，用尖嘴鑷子將腹部取下，解剖腹部末端，得到雌蜂生殖系統(tǒng)，將卵巢及輸卵管取下，用無菌生理鹽水清洗后放入冰浴的Ringer's溶液中。將解剖得到的卵巢放于玻璃勻漿器中勻漿，連同生理鹽水吸入離心管中。

1.1.3紫外光輻射處理雌蜂用30W紫外燈光照射交配過的200頭雌蜂3h，分別寄生100頭3～4齡若蚜。隨后按上述方法讓其寄生2齡末、3齡、4齡初若蚜，每日解剖20頭被寄生各齡期寄主，觀察各處理寄生蜂卵孵化情況。以未經(jīng)照射處理的正常雌蜂寄生的同齡若蚜做比較，觀察假寄生對寄主若蚜發(fā)育的影響，同時(shí)以未寄生的同齡若蚜作對照[8]。

1.1.4被寄生蚜蟲的解剖將上述3～4齡若蚜200頭分別放到100個(gè)指形管（Φ=1.0cm，h=5.0cm）中，再分別引入100頭雌蜂，使每個(gè)指形管中有2頭蚜蟲和1頭雌蜂，持續(xù)產(chǎn)卵1h后，取出被寄生的煙蚜，放在75%的酒精中消毒，再用無菌生理鹽水清洗除去雜質(zhì)及酒精，然后將煙蚜放在滴有4℃冰冷的無菌生理鹽水的載玻片上，用解剖針剔除蟲體的前胸和翅，以一針按住腹部前端的腹面，用另一針自腹部前端背面起，輕輕拉開蚜蟲體壁，再用自制的毛細(xì)吸管將血淋巴吸入到冰冷的離心管中備用。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1PDV的分離純化PDV的分離純化參照Krell和Beckage等的方法[9-10]。用TL-18M型臺式高速冷凍離心機(jī)在8000r/min離心3min，以去掉組織碎片，沉淀用Ringer's溶液洗1次后再離心1次，合并上清液，作為提純PDV的樣品。將樣品鋪在25%～65%（W/V）的蔗糖連續(xù)梯度上，用Hitachi,P50離心機(jī)在48000r/min（HITA⁃CHISCR20BC冷凍高速離心機(jī)HirachikokiCo.LTd.,TokyoJapan日立RP30A轉(zhuǎn)頭）4℃下離心6h。用毛細(xì)管收集沉降帶后，再用Ringer's溶液洗1遍，在48000r/min4℃下再離心30min，將沉淀溶于適量的Ringer's溶液中，于-70℃冰箱保存。

1.2.2鏡檢

1.2.2.1取材取上述所得的上清液，倒少量置于蠟板上的雙蒸水中，靜置15min，使其自行擴(kuò)散成懸浮液。

1.2.2.2制樣將敷有福爾莫瓦膜的載網(wǎng)漂浮在樣品液滴上以沾取樣品，用濾紙吸干余液，使樣品在載網(wǎng)上僅有一薄層液膜；同時(shí)，用2%磷鎢酸（pH6.8）染色1～2min,用濾紙吸干多余的染液。

1.2.2.3微形態(tài)觀察在透射電子顯微鏡下進(jìn)行微形態(tài)觀察。

2結(jié)果與討論

2.1形態(tài)學(xué)特性用蔗糖密度梯度離心法提純的病毒，可在第3條沉降帶（蔗糖40%濃度）出現(xiàn)。經(jīng)電鏡觀察，收集的沉降帶及煙蚜繭蜂卵巢萼液中的病毒粒子如圖1、圖2所示。該病毒粒子呈多面體狀，數(shù)量較少，無包涵體?？沙醪阶C明在煙蚜繭蜂卵巢萼液中有毒粒子存在。被寄生的桃蚜體內(nèi)毒粒子呈多面體，形狀與煙蚜繭蜂卵巢萼液中毒粒子相似，可認(rèn)為該病毒粒子是煙蚜繭蜂產(chǎn)卵時(shí)攜帶進(jìn)來的。蚜繭蜂卵巢萼液和被寄生的蚜蟲體液經(jīng)過離心處理，經(jīng)負(fù)染色，在透射電子顯微鏡下可觀察到病毒粒子，經(jīng)確認(rèn)是多分DNA病毒（圖3）。本研究取材僅有100對煙蚜繭蜂的卵巢，經(jīng)梯度離心提純后，病毒粒子的濃度較小，因此在用電鏡觀察到的病毒粒子較少，應(yīng)取材更多。

2.2生理效應(yīng)經(jīng)紫外光處理后的雌蜂都能正常產(chǎn)卵寄生，對被寄生寄主的發(fā)育歷期進(jìn)行連續(xù)解剖發(fā)現(xiàn)，96.4%±2.8%不能孵化，個(gè)別發(fā)育不完善，并且絕大多數(shù)的蜂卵未能被寄主的免疫系統(tǒng)所識別而進(jìn)行血細(xì)胞包囊。假寄生的2齡末、3齡和4齡初寄主若蟲期延長，對一次假寄生的寄主而言，若蟲期延長8～12d，而多次假寄生的寄主，當(dāng)發(fā)育到第11d后，轉(zhuǎn)化成僵蚜，說明PDV與復(fù)合因子劑量增加對寄生生長和發(fā)育有明顯抑制作用[11]。4齡末蚜蟲若蟲被假寄生后，即使被過寄生6次，依然能正常發(fā)育，但隨后轉(zhuǎn)化成僵蚜（圖4）。

3結(jié)論與討論

本文證實(shí)煙蚜繭蜂體內(nèi)存在多分DNA病毒，其功能是直接侵染或間接作用于寄主漿細(xì)胞和顆粒細(xì)胞，改變寄主血細(xì)胞行為，抑制寄主細(xì)胞免疫反應(yīng)，破壞寄主免疫，使蜂卵免遭包囊以確保子代存活，對寄主生長和發(fā)育有明顯抑制作用。在病毒與寄主昆蟲長期進(jìn)化過程中，PDV可通過調(diào)節(jié)寄主的內(nèi)分泌來加快或減慢寄主的發(fā)育等途徑來調(diào)節(jié)寄主幼蟲生長期的長短，如可通過降低保幼激素酯酶的活性[12]。但對于煙蚜繭蜂和蚜蟲模式體系內(nèi)PDV是如何作用于寄主，是否整合于寄生蜂的染色體上，進(jìn)入寄主體內(nèi)是以何種方式進(jìn)行轉(zhuǎn)染及表達(dá)[13-14]，以上所有情況尚需作進(jìn)一步的研究。未來在完全明確多分DNA病毒基因的功能和表達(dá)調(diào)控機(jī)理的基礎(chǔ)上，可選用合適的昆蟲轉(zhuǎn)座子，以顯微注射等方法將多分DNA病毒基因整合到害蟲基因組中，培育出免疫力和繁殖力下降，發(fā)育紊亂的害蟲品系，通過在田間散發(fā)這種轉(zhuǎn)基因害蟲，以達(dá)到控制種群的目的[15-16]。多分DNA的應(yīng)用前景比較廣闊，對它做進(jìn)一步研究很有價(jià)值和意義[17]。

作者：李艷紅 劉金文 顏秀娟 單位：吉林農(nóng)業(yè)工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院