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《大連海洋大學學報》2016年第3期

摘要:

為研究萱藻的絲狀體育苗,以大連沿海萱藻為材料,采用配子孤雌生殖方法,進行了絲狀體的誘導及采苗、育苗研究。結果表明:單株種藻獲得的配子經孤雌生殖形成的盤狀體在20益時生長最快,15益時次之,10益時最慢;盤狀體直徑達到100滋m以上時開始形成絲狀體,絲狀體在20益時形成的時間最短、數量最多、生長速度最快,15益時次之,10益時最差;將絲狀體剝下經增殖后切碎采苗,在10益時幼苗形成最快、形成率最高,15益時次之,20益時無幼苗形成;在10益時,采苗后培養30d幼苗長度達到(110依03)mm,移至海區栽培4個月后獲得藻體長度為60cm左右的萱藻成體。

關鍵詞:

萱藻;配子;孤雌生殖;絲狀體;采苗;室內培養

萱藻是經濟價值較高的一年生大型經濟褐藻,在中國北至遼寧、南至廣東沿海均有分布,萱藻在冬春季生長繁茂,藻體最大長度可達80~110cm,能在近岸潮間帶和潮下帶的巖礁區形成大的藻場,是中國沿海重要的海藻資源[1-2]。萱藻營養豐富、味道鮮美,是人們喜歡食用的主要海藻之一[3]。研究發現,萱藻中氨基酸含量豐富且種類齊全,共含有7種人體必需氨基酸、2種半必需氨基酸和7種非必需氨基酸,其中天門冬氨酸和谷氨酸含量占總氨基酸的20%以上,兒童生長發育必需的精氨酸和組氨酸含量也較高[4],而且萱藻中巖藻聚糖硫酸脂含量豐富,具有顯著的護肝作用[5]。近年來,萱藻作為健康和保健食品,市場需求量迅速增大,有關萱藻規?；绶N生產技術、海區栽培技術的研究已經引起人們的關注。目前,國內外有關萱藻的研究報道多集中在其生活史和生態學方面[6-10],關于萱藻人工育苗的研究報道較少,久保昭史[11]進行了配子(合子)采集和盤狀體孢子體培養初步研究;三浦昭雄[12]將室內培養的盤狀孢子體切碎并附著在維尼綸繩上,在海區浮筏上培育出萱藻幼苗;張澤宇等[13]從合子萌發形成的盤狀孢子體上得到絲狀體,將絲狀體再轉化為盤狀孢子體并培養至形成單室孢子囊,采集從成熟孢子囊放出的孢子并在室內培育出萱藻幼苗。本研究中利用萱藻配子異宗結合的特點,用單株藻體采集配子的方法,從配子孤雌生殖形成的盤狀體上獲得絲狀體,經增殖后,采用絲狀體采苗的方法將絲狀體切碎并使其附著在維尼綸繩網簾上,絲狀體細胞直接萌發為萱藻幼苗,并將其在海區浮筏上栽培成成體,可將育苗時間縮短為20~30d。作者根據試驗結果,掌握了盤狀體生長以及絲狀體形成、生長和采苗期的最適宜溫度,可為萱藻的規?；绶N生產提供理論指導。

1材料與方法

1.1材料試驗

用萱藻種藻于2014年4月采集于大連市黑石礁海區自然種群,采集時取藻體表面形成配子囊的成熟種藻(圖1),單株用海水洗凈后分別放入塑料袋內,帶回實驗室供試驗使用。

1.2方法

1.2.1配子放散與采集將單株種藻鋪放在白紙上,在室內陰干2~3h后,分別放入盛有100mL消毒海水的200mL燒杯內,在光照強度逸60滋mol/(m2·s)下刺激配子放散,當有褐色煙霧狀配子放散后撈出種藻,用吸管在向光處水表面配子趨光集中的褐色區域汲取配子水,分別取2~3滴移入數個鋪有載玻片的培養皿(直徑15cm)內,添加培養液后在室溫下靜置過夜,于次日上午移到溫度為20益、光周期為12h/d、光照強度為40滋mol/(m2·s)的條件下培養。

1.2.2盤狀體的形成及生長試驗將附著胚配子的載玻片移至直徑為9cm的培養皿(下同)內,添加培養液后置于不同溫度下進行培養,每5d測定1次盤狀體的生長狀況,測定50個盤狀體的直徑并取其平均值。

1.2.3溫度對絲狀體形成和生長的影響試驗在溫度為20益、光照強度為40滋mol/(m2·s)、光照周期為12h/d的條件下,盤狀體直徑達到100滋m左右時,將生長盤狀體的載玻片移到培養皿內,添加培養液后移至不同溫度下進行培養。每10d檢查1次盤狀體,每次測量50個盤狀體,按形成絲狀體的盤狀體數與盤狀體總數的百分比計算絲狀體形成率。將生長在盤狀體表面的絲狀體剝下,移至盛有培養液的300mL燒瓶中,培養至肉眼可見的藻團時,將絲狀體藻團移到載玻片上,用雙面刀片切碎后撒在鋪有載玻片的培養皿內,添加培養液后靜置過夜,次日上午將附著絲狀體藻段的載玻片分別移入裝有培養液的不同培養皿內,并置于不同溫度下進行培養。每5d測定1次絲狀體的生長狀況,每次測量50個絲狀體的長度并取其平均值。

124絲狀體切碎及幼苗培養取增殖后的絲狀體藻團2g(濕質量),添加300mL培養液后,用組織搗碎機(PhilipHR2096)切碎,時間為120s,在測定藻段長度后,灑在鋪有載玻片的培養皿內,附著3d后,將載玻片移至直徑為15cm的培養皿內,添加培養液后置于不同溫度下進行培養。每5d測定1次幼苗形成率,每次測量50個絲狀體,按形成幼苗的絲狀體數與絲狀體總數的百分比計算幼苗形成率;最后將形成幼苗的載玻片移入不同培養皿內,并置于不同溫度下進行培養。每5d測定1次幼苗生長狀況,每次測量50個個體的長度并取其平均值。以上培養過程均在恒溫培養箱內進行,溫度分別設定為10、15、20益,光源為日光燈,光照周期為12h/d,光照強度為40滋mol/(m2·s)。培養液為過濾后加熱至80益以上再冷卻的海水,營養鹽的添加量為NaNO3100mg/L,KH2PO420mg/L,微量元素PI溶液[14]1mL/L,每3d全量更換培養液1次。

1.2.5幼苗培育及海區栽培2014年10月20日,將增殖后的孤雌生殖絲狀體采用相同方法切碎,灑在鋪有維尼綸繩網簾的塑料水槽(水體03t)內,待附著牢固后,將網簾移入玻璃鋼水槽(水體2t)內進行培養。培養用水為過濾的自然海水,營養鹽添加量為NaNO320mg/L,NaH2PO410mg/L,培養用水每3d全量更換1次,待幼苗肉眼可見時移至海區浮筏上栽培。

2.結果與分析

2.1配子附著、萌發與盤狀體的形成及生長

配子呈梨形,大小為(60~70)滋m伊(35~50)滋m,色素呈體盤狀,具眼點,側生兩條不等長鞭毛(圖2-A)。配子放散具正趨光性,附著時表現出負趨光性,游向背光處并附著。配子附著時長鞭毛接觸基質并快速旋轉將鞭毛收回體內,當配子前端與基質接觸后停止旋轉并附著,成為胚配子。胚配子為圓形,直徑約5滋m,在20益下24h后開始萌發,細胞首先在側面產生突起并拉長呈長圓形,經2~3次細胞橫分裂后形成5~7個細胞的長條狀盤狀體(圖2-B),隨后細胞開始向周邊分裂,形成多細胞盤狀體。剛形成的盤狀體呈圓形或橢圓形,直徑為20~30滋m,由數十個橢圓形細胞組成,呈放射狀排列,細胞內含1個褐色的盤狀色素體。在20益下,盤狀體細胞首先沿著基質的表面分裂增加附著面積,培養15d時,盤狀體直徑達到60滋m以上。之后盤狀體中部細胞橫分裂加快,由中央開始逐漸向上隆起,厚度逐漸增加。培養25d時,盤狀體直徑均超過100滋m,中央部略隆起,盤狀體進入快速生長階段,周邊外層可見由透明長方形分生細胞組成的分生膜。培養2個月時,盤狀體直徑達2mm左右,肉眼已清楚可見。從表1可見,培養20d時,20益下盤狀體直徑為(800依30)滋m,15益和10益下分別為(600依20)、(450依20)滋m;培養30d時,20益下盤狀體直徑增加至(1200依40)滋m,明顯大于15益和10益下的(850依30)、(600依30)滋m。

2.2溫度對絲狀體、葉狀體形成的影響

當盤狀體直徑達到100滋m左右時,其中央及周邊部分表面細胞拉長并延伸出盤狀體表面,細胞內原生質向上移動使細胞頂端膨大呈褐色棒狀,部分棒狀細胞經2~3次細胞橫分裂,形成3~5個細胞的絲狀體,經生長后形成多細胞絲狀體(圖2-C)。剛形成的絲狀體為單條絲狀體,絲狀體長為300~400滋m,寬為120~150滋m,內含褐色盤狀色素體,隨后產生分枝并生長成為分枝絲狀體藻團。從表2可見:在20益下,培養5d時開始形成絲狀體,培養10d時形成率達到(250依50)%,培養30d時絲狀體形成率達到100%,每個盤狀孢子體上一般都形成多個絲狀體;在15益下,培養10d時,盤狀體上開始形成絲狀體,培養30d時,絲狀體形成率為(800依60)%;在10益下,培養20d時,盤狀體上才開始形成絲狀體,培養30d時,絲狀體形成率僅為(200依30)%,且每個盤狀孢子體上形成的絲狀體數量均明顯少于20益和15益下形成的絲狀體數量(P<001)。葉狀體是由2~5列細胞組成的細長藻體,一般形成于盤狀體中部。開始時盤狀體中部細胞顏色加深,分裂加快,隨后延伸出盤狀體表面并生長成為葉狀體(圖2-D)。當葉狀體生長到一定長度(200滋m左右)時生長停止,藻體逐漸失去光澤、變厚,縱裂為2~5條由單列細胞組成的絲狀體(圖2-E)。葉狀體的產生非常普遍,且每個盤狀體上產生葉狀體的數量也較多,部分盤狀體上形成的葉狀體可達十余棵。

2.3溫度對絲狀體生長的影響

切碎后的絲狀體藻段長度為70~230滋m,平均為160滋m,依靠破碎細胞溢出的原生質黏附在基質上。絲狀體生長時,首先細胞拉長,細胞內的盤狀色素體也隨之變細拉長,隨后細胞中間產生隔閡,色素體和原生質也被分隔,分裂為2個細胞,在顯微鏡下可見多個細胞同時進行細胞分裂,藻體長度增加很快,在20益下培養1個月時,可生長成長度為5mm左右的單列細胞絲狀體。隨后絲狀體兩側產生少數分枝并延長為分枝絲狀體,培養2個月時,生長成直徑為5mm左右的絲狀體藻團。不同溫度對絲狀體生長的影響如表3所示。從表3可見,培養30d時,絲狀體的長度在20益下達到(64依03)mm,在15益下為(47依04)mm,在10益下僅為(30依01)mm。結果表明,在設定的3個溫度條件下,絲狀體在20益下生長最快,15益下次之,10益下最慢。隨著培養時間的增加,絲狀體藻團細胞分裂旺盛,長度快速增加,同時部分細胞縮短變粗,細胞內原生質濃度增加呈黑褐色。之后,筒狀細胞逐漸膨大,在其上端或下端向周邊環生出多個圓形小細胞,經生長后聚集在一起形成節狀細胞團。節狀細胞團多環生于細胞隔閡處,由十余個或幾十個直徑為6~10滋m的圓形細胞組成,細胞內具有1個盤狀色素體和豐富的原生質,呈黑褐色。培養后絲狀體藻團的絲狀體上形成大量節狀細胞團(圖2-F)。

2.4幼苗的形成與生長擴增后的絲狀體

如圖3-A所示,經切碎后的絲狀體藻段長度為110~230滋m,平均為155滋m,依靠切斷細胞溢出的原生質黏附在基質上。在10益下切碎3d后,在顯微鏡下可見絲狀體細胞逐漸變短,細胞內原生體濃度增加并呈褐色,細胞表面產生突起并向上延伸呈透明棒狀,細胞內的盤狀色素體及原生質向棒狀細胞內移動,使棒狀細胞呈淺褐色,隨后棒狀細胞逐漸拉長并分裂為2~3個細胞,上部細胞頂端生出透明無色毛,基部細胞向下延伸出透明假根絲,附著在基質上成為萱藻幼苗。一般情況下,絲狀體藻段與基質接觸的兩端細胞先形成幼苗,未與基質接觸的細胞和絲狀體藻段的中間細胞形成幼苗相對較晚,隨著培養時間的延長,幾乎所有絲狀體藻段細胞均能形成幼苗,顯微鏡下可見1個絲狀體藻段上有多棵幼苗生出(圖3-B)。節狀細胞團被打碎后散落在基質上,在10益下,圓形細胞3d時開始增大,與基質的附著面變為扁圓形,隨后表面產生突起并延伸成棒狀細胞,細胞內的色素體和原生質移動到棒狀細胞內后成為透明細胞空殼,并與棒狀細胞相連。隨后棒狀細胞基部產生隔閡并分裂成3~5個細胞,上部細胞頂端生出無色毛,下部細胞生出假根絲并延伸到基質表面成為萱藻幼苗。不同溫度對幼苗形成率的影響見表4。從表4可見,溫度對幼苗形成率的影響極顯著(P<001)。10益下,絲狀體細胞切碎5d時便開始形成幼苗,10d時幼苗形成率為(240依20)%,20d時形成率為(850依80)%,30d時形成率達到100%;15益下,絲狀體細胞切碎10d時開始形成幼苗,20d時幼苗形成率為(180依20)%,30d時形成率為(450依50)%;20益下,絲狀體只進行旺盛的細胞分裂,切碎30d時也沒有幼苗形成。不同溫度對幼苗生長的影響如表5所示。從表5可見:在10益下,培養10d時幼苗長度為(12依02)mm,20d時長度增加至(52依01)mm,30d時長度達到(110依03)mm;在15益下,培養10d時幼苗長度為(08依01)mm,20d時長度為(32依03)mm,30d時長度為(62依04)mm;20益下,培養10d時幼苗長度為(05依01)mm,20d時長度為(12依02)mm,30d時長度僅增至(24依01)mm,顯微鏡下可見幼苗呈彎曲狀,藻體表面細胞凹凸不平,部分藻體已經死亡。

2.5幼苗培育及栽培

附著在維尼綸網簾上的絲狀體細胞在培育10d左右時陸續形成幼苗,培養40d時幼苗藻體長度已達10cm左右(圖3-C),隨后于2014年11月30日,研究人員將生長在維尼綸繩網簾的幼苗移至海區浮筏上栽培,4個月后生長成藻體長度為60cm左右的萱藻成體(圖3-D)。

3.討論

萱藻的常規人工育苗要經歷合子采集、盤狀體孢子體室內培育、游孢子采集和幼苗培育等階段,一般需要6個月左右的培育時間。由于育苗時間長,特別是在夏季高溫期內,雜藻大量繁衍導致盤狀孢子體死亡或發育程度降低,難以獲得大量孢子,導致育苗失敗[11-12]。本研究中,根據萱藻配子異宗結合的特點[6],從單株種藻采集的配子孤雌生殖形成盤狀體上獲得絲狀體,經增殖后,采用絲狀體采苗的方法,將絲狀體切碎并撒在維尼綸繩等附著基上,絲狀體細胞直接萌發形成萱藻幼苗,將育苗時間縮短到20~30d。張澤宇等[13]報道了使用從萱藻配子結合后的合子萌發形成的盤狀體上獲得的絲狀體進行采苗和育苗的研究結果,但該方法中切碎后的絲狀體仍要經歷盤狀孢子體形成、生長,以及單室孢子囊形成、成熟和游孢子放散等階段,同樣存在著育苗時間長、夏季高溫期難以逾越的問題。溫度是影響絲狀體形成和幼苗萌發的最重要因子之一。本試驗中發現,10~20益范圍內,溫度越高越利于絲狀體的形成和生長,但溫度越低越利于幼苗的形成。10益下,切碎的絲狀體細胞在短時間內可形成幼苗,且隨著培養時間的延長幾乎所有的細胞均可形成幼苗,但在此溫度下,絲狀體幾乎不生長;15益下,只有部分枝端細胞和與基質接觸的絲狀體細胞形成幼苗,未形成幼苗的絲狀體仍在繼續生長;20益下,絲狀體細胞不形成幼苗,只進行細胞分裂,增加絲狀體長度,且生長速度明顯快于15益。絲狀體生長和幼苗萌發適應不同溫度的特性為其增殖培養和采苗提供了便利的條件,作者于2014年采用20益下絲狀體切碎增殖的方法,在2~3個月內獲得了大量的絲狀體,在秋季自然水溫降至12益左右時將絲狀體切碎并撒在維尼綸繩等附著基上,在常溫下成功地培育出一定數量的萱藻幼苗。不同溫度對圓形細胞形成幼苗的影響與絲狀體藻段基本相同,20益下,圓形細胞拉長后經多次細胞分裂又形成了絲狀體。10益下,由圓形細胞形成的幼苗生長很快,藻體先進行細胞橫分裂,成為十余個細胞的單列細胞藻體后,藻體基部細胞逐漸增大,向下分生出多條假根絲,經分裂形成盤狀固著器附著在基質上。隨后,自基部細胞開始細胞縱分裂,形成多列細胞藻體,再經過多次縱橫分裂后生長成為肉眼可見的圓柱狀萱藻幼苗。

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作者：李曉麗 申元 曹淑青 張澤宇 單位：大連海洋大學農業部北方海水增養殖重點實驗室