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《福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)》2016年第8期

摘要：

研究了固液比、提取溫度和時(shí)間對(duì)制備的福建紅曲米粗酶液酶活的影響，比較了以碘量法、DNS法和菲林試劑法的紅曲米糖化力測(cè)定結(jié)果，并進(jìn)行紅曲黃酒釀造驗(yàn)證糖化力檢測(cè)試驗(yàn)。結(jié)果表明，紅曲米糖化酶最佳提取方式為選擇固液比（m∶V）＝1g∶25mL，紅曲米粉末于緩沖液溶解搖勻后立即過(guò)濾，取濾液檢測(cè)。碘量法與DNS法均為紅曲米糖化酶適宜的檢測(cè)方法，兩種方法檢測(cè)數(shù)據(jù)具有可比性。從時(shí)效性考慮，碘量法適宜少量樣品測(cè)定，DNS法適宜用于快速測(cè)定多個(gè)樣品。經(jīng)釀造驗(yàn)證，紅曲米糖化力的測(cè)定值與以其為糖化劑的黃酒出酒率檢測(cè)結(jié)果是一致。

關(guān)鍵詞：

紅曲米；糖化酶；糖化力

紅曲米是我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品，以秈稻、粳稻、糯米等稻米為原料，用紅曲霉菌發(fā)酵而成，在釀造福建黃酒過(guò)程中，發(fā)揮了提供色澤、風(fēng)味和糖化等作用［1－2］。糖化力是衡量紅曲米糖化力作用強(qiáng)弱的一個(gè)重要指標(biāo)。然而，如何判斷紅曲米糖化力強(qiáng)弱至今沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。糖化酶提取方法直接影響到紅曲米糖化力測(cè)定的高低，提取方式就有很多種，如溫小英［3］等采用35℃浸提1h的方法提取，汪志君［4］等采用30℃浸提1h，馬歌麗［8］等采用緩沖液直接提取。不同的提取方法對(duì)糖化酶活力影響不同，高溫長(zhǎng)時(shí)的提取方法有可能造成酶活損失。同時(shí)，測(cè)定糖化力的方法有很多，國(guó)標(biāo)針對(duì)糖化酶制劑采用碘量法［5］，該方法準(zhǔn)確可靠，操作復(fù)雜，尤其在處理大量樣品時(shí)，分析速度慢，對(duì)糖化力較低的樣品則顏色變化不明顯，判斷誤差較大；胡衛(wèi)明［6］、馬耀宏［7］等采用菲林試劑法，此法應(yīng)用較為廣泛，但張鳳英［8］等認(rèn)為其影響因素較多，且操作繁瑣、時(shí)間長(zhǎng)，測(cè)定技術(shù)要求高，結(jié)果差異大；白利濤［9］、馬歌麗［10］等研究了DNS法測(cè)定糖化酶活力，認(rèn)為DNS法和碘量法在精密度和正確度上都無(wú)顯著差異，操作簡(jiǎn)便，對(duì)于多個(gè)樣品可實(shí)現(xiàn)快速測(cè)定；許明明［11］等采用試飯法直接測(cè)定。本研究考察了固液比、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)粗酶提取液酶活的影響，同時(shí)對(duì)比了碘量法、DNS法和菲林試劑法，并對(duì)釀造紅曲米糖化力檢測(cè)進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，以期為釀造紅曲米檢測(cè)技術(shù)規(guī)程的制訂以及紅曲米糖化力評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1．1原料

紅曲米，由福建永春、平湖、三明、寧德等地收集。

1．2儀器與藥品

GX－04多功能粉碎機(jī)，上海高翔食品機(jī)械廠；電熱恒溫水浴鍋；BS224S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器。

1．3試驗(yàn)方法

1．3．1試劑

0．05mol•L－1乙酸－乙酸鈉緩沖溶液（pH4．6），DNS試劑，200g•－1氫氧化鈉，20g•－1可溶性淀粉溶液，0．1％葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1．3．2粗酶液提取

紅曲米用多功能粉碎機(jī)打成粉末（80目），精確稱取適量粉末，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)以0．05mol•L－1乙酸－乙酸鈉緩沖溶液為溶劑，經(jīng)一定溫度、時(shí)間下浸提后抽濾，洗滌3次，收集濾液定容至250mL，待用。

1．3．3單因素試驗(yàn)

為了考察固液比、提取溫度和時(shí)間對(duì)粗酶提液酶活的影響，按1．3．2方法進(jìn)行以下3個(gè)單因素試驗(yàn)。固液比（m／g∶V／mL）分別為1∶100、1∶50、1∶25、2∶25、3∶25、4∶25、5∶25，在40℃水浴中進(jìn)行浸提40min；以較優(yōu)固液比，在4、20、30、40、50℃水浴中浸提40min；以較優(yōu)固液比，在最適溫度水浴中分別進(jìn)行浸提0、10、20、30、40min。每處理重復(fù)2次。

1．43種檢測(cè)方法比較

1．4．1碘量法

參考GB8276－2006，略作修改。糖化酶酶解：取兩支50mL比色管（A、B管），分別加入可溶性淀粉溶液10mL和乙酸－乙酸鈉緩沖液8mL，搖勻。于40℃恒溫水浴中預(yù)熱5～10min。在B管中加入待測(cè)酶液10．0mL，立即記時(shí)，搖勻。在此溫度下準(zhǔn)確反應(yīng)60min后，立即向A、B管中各加氫氧化鈉溶液0．2mL，搖勻，同時(shí)將兩管取出，迅速用水冷卻，并于A管中補(bǔ)加待測(cè)酶液10．0mL作為空白對(duì)照。測(cè)定：吸取上述A、B兩管中的反應(yīng)液各5．0mL，分別于兩個(gè)碘量瓶中，準(zhǔn)確加入碘標(biāo)準(zhǔn)溶液10．0mL，再加氫氧化鈉溶液15mL，邊加邊搖勻，并于暗處放置15min，取出。用水淋洗瓶蓋，加入硫酸溶液2mL，用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定藍(lán)紫色溶液，直至剛好無(wú)色為其終點(diǎn)，分別記錄空白和樣品消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積（VA、VB）。紅曲米酶活力單位按下式計(jì)算：X＝（VA－VB）×cST×cG×（Vt／Vx）×（1／10）×n式中：X為樣品的酶活力單位即1g紅曲米在40℃、pH4．6的條件下，1h水解可溶性淀粉的產(chǎn)生1mg葡萄糖為1個(gè)酶活力單位（U•g－1）；VA為滴定空白時(shí)，消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積（mL）；VB為滴定樣品時(shí)，消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積（mL）；cST為硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的準(zhǔn)確濃度（mol•L－1）；cG為葡萄糖的摩爾質(zhì)量，90．05g•mol－1；Vt為反應(yīng)液的總體積，24．2L；Vx為吸取反應(yīng)液的體積，5L；n為稀釋倍數(shù)。

1．4．2DNS法

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：準(zhǔn)確稱取105～110℃干燥后的葡萄糖50mg，用蒸餾水溶解，定容至50mL容量瓶中，配置成1mg•mL－1標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別稀釋為0．1、0．2、0．3、0．4、0．5mg•mL－1的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，分別吸取0．5mL，分別于在25mL比色管中，加入1．5mLDNS試劑混勻，在沸水浴中加熱5min后取出迅速冷卻至室溫，加水10mL。以試劑空白作參比，用1cm比色皿在520nm測(cè)定吸光度。以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性回歸方程。

（2）糖化力測(cè)定：糖化酶酶解方法與碘量法的相同測(cè)定方法參考馬歌麗［10］、孫淑琴［12］，上述A、B兩管中的反應(yīng)液稀釋至0．5mL，分別于在25mL比色管中，加入1．5mLDNS試劑在沸水浴中加熱5min后取出迅速冷卻至室溫，加水10mL。以試劑空白作參比，用1cm比色皿在520nm測(cè)定吸光值，分別通過(guò)線性回歸方程求出葡萄糖濃度。紅曲米酶活力單位按下式計(jì)算：X＝（cB－cA）×（Vt／VEX）×（VET／m）×n式中：X為樣品的酶活力，即1g紅曲米在40℃、pH4．6的條件下，1h水解可溶性淀粉的產(chǎn)生1mg葡萄糖為1個(gè)酶活力單位（U•g－1）；cB為樣品管的葡萄糖質(zhì)量濃度（mg•mL－1）；cA為樣品空白管的葡萄糖質(zhì)量濃度（mg•mL－1）；Vt為反應(yīng)液的總體積，單位為毫升（28．2mL）；VEX為吸取待測(cè)酶液的體積，為10mL；VET為提取待測(cè)酶液的總體積，為25mL；m為稱取紅曲米粉末重量（g）；n為稀釋倍數(shù)。

1．4．3菲林試劑法

方法參考馬耀宏［7］等，略作修改。吸取25mL12％可溶性淀粉溶液，置于50mL容量瓶，于35℃水浴預(yù)熱10min，加入5mL酶提取液，搖勻，于35℃糖化1h，迅速加入15mL0．1mol•L－1NaOH，終止酶解反應(yīng)，冷卻至室溫，定容。吸取斐林試劑甲、乙液各5mL，加入適量的0．1％標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液（使滴定時(shí)消耗0．1％標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液在1mL以內(nèi)），準(zhǔn)確加入5mL上述酶解液，搖勻，于電爐上加熱至沸騰，立即用0．1％標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液滴定至藍(lán)色消失，操作在1min內(nèi)完成，并同時(shí)做空白液滴定。計(jì)算公式：X＝（V0－V）×C×（1／m）×105×n式中：X為樣品的酶活力單位即1g紅曲米在40℃、pH4．6的條件下，1h水解可溶性淀粉的產(chǎn)生1mg葡萄糖為1個(gè)酶活力單位（U•g－1）；V0為滴定空白時(shí)，消耗0．1％標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液體積（mL）；V為滴定樣品時(shí)，消耗0．1％標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液體積（mL）；c為標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液質(zhì)量濃度（g•mL－1）；m為紅曲重量，單位為（g）；n為稀釋倍數(shù)。

1．5紅曲黃酒釀造驗(yàn)證試驗(yàn)

采用傳統(tǒng)發(fā)酵法，以糯米為原料，以5種紅曲米為糖化劑，糯米經(jīng)浸泡、蒸煮攤涼，以米飯∶水為1∶1落缸，按大米用量的10．0％接種紅曲米，控溫30℃發(fā)酵，發(fā)酵72h后離心，檢測(cè)酒精度和出酒率。酒精度：采用高效液相色譜法測(cè)定酒精度［13］。殘?zhí)恰⒖偹釡y(cè)定：參考GB／T13662－2008黃酒［14］中總糖、總酸的檢測(cè)。出酒率（以成品酒15度計(jì)）的測(cè)定：出酒率％＝酒精度（％）×［出酒量（kg）／大米用量（kg）×100％1．6數(shù)據(jù)分析采用DPS數(shù)據(jù)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果與分析

2．1液固比對(duì)粗酶提取的影響

采用DPS數(shù)據(jù)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，不同液固比處理所得到的粗酶提取液酶活見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，固液比（m／g∶V／mL）分別為1∶100、1∶50、1∶25時(shí)，粗酶提取液酶活最高，三者無(wú)顯著差異（P＞0．05），原因是緩沖液提取酶的量達(dá)到最大量，為操作簡(jiǎn)便，選擇固液比為1∶25。

2．2浸提溫度對(duì)粗酶提取的影響

采用DPS數(shù)據(jù)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，當(dāng)固液比m／g∶V／mL＝1∶25時(shí)，不同浸提溫度處理所得到的粗酶提取液酶活見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，提取溫度越低，酶活越低，原因可能是當(dāng)提取溫度升高，酶失活的比率逐漸上升，酶活降低；當(dāng)提取溫度為4℃時(shí)，酶活最高，與其他溫度提取的酶活相比，差異均達(dá)極顯著水平（P＜0．01）。

2．3浸提時(shí)間對(duì)粗酶提取的影響

采用DPS數(shù)據(jù)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，在固液比m／g∶V／mL＝1∶25、浸提溫度4℃時(shí)，不同浸提時(shí)間處理所得到的粗酶提取液酶活見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，不同的浸提時(shí)間對(duì)粗酶提取液酶活沒(méi)有顯著差異，為了操作簡(jiǎn)便，選擇混勻后立即過(guò)濾。

2．43種檢測(cè)方法比較

對(duì)11種不同產(chǎn)地、不同來(lái)源的紅曲米進(jìn)行初篩，選擇5種糖化力差異較大的紅曲米（B1、R12、R21、R32、R8），分別采用了碘量法、DNS法、菲林試劑法3種檢測(cè)方法進(jìn)行了糖化力測(cè)定，從圖4可以看出，碘量法與DNS法檢測(cè)結(jié)果基本一致，5種紅曲米糖化力大小順序依次為B1、R12、R21、R32、R8，排序一致，兩種方法的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著差異；菲林試劑法檢測(cè)5種紅曲米糖化力大小順序依次為B1、R21、R32、R8、R12，只有B1排序有相關(guān)性，其余4個(gè)樣品檢測(cè)結(jié)果均有一定的偏差，與張鳳英［6］等研究結(jié)果一致，同時(shí)菲林試劑法檢測(cè)值偏低。3種檢測(cè)方法對(duì)時(shí)間、試劑、設(shè)備等要求見(jiàn)表1，菲林試劑法操作難度較難，誤差較大。檢測(cè)方法可根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)需求進(jìn)行選擇。在樣品數(shù)量較少、設(shè)備條件有限的情況下，適宜選擇碘量法檢測(cè)紅曲米糖化力；在樣品數(shù)量較多，有分光光度計(jì)的條件下，可以選擇DNS法快速測(cè)定多個(gè)樣品，兩種方法的測(cè)定值具有可比性。

2．5紅曲米糖化力驗(yàn)證試驗(yàn)

紅曲米糖化力的高低，直接反映其液化糖化大米淀粉產(chǎn)生可發(fā)酵糖的水平，最終關(guān)系到出酒率。從圖5可以看出，紅曲米糖化力的差異與以其為糖化劑的黃酒出酒率的差異是一致的，進(jìn)一步說(shuō)明了檢測(cè)數(shù)據(jù)是可信的。

3討論與結(jié)論

紅曲的糖化力是反映紅曲質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。受制曲原料、加工工藝和生產(chǎn)條件的影響，不同產(chǎn)地、不同廠家甚至不同批次生產(chǎn)的酒曲，都存在較大差異。因此，針對(duì)紅曲建立一個(gè)有效的糖化力評(píng)價(jià)方法，對(duì)于穩(wěn)定酒曲質(zhì)量、制曲企業(yè)制訂行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、釀酒企業(yè)選擇使用紅曲，具有重要的指導(dǎo)意義。DNS法的原理是糖化酶水解淀粉產(chǎn)生的葡萄糖與3，5－二硝基水楊酸（DNS）反應(yīng)生成的棕紅色3－氨基－5硝基－水楊酸，在520nm波長(zhǎng)處的光吸收強(qiáng)度與還原糖含量呈正比，利用分光光度計(jì)快速簡(jiǎn)便的測(cè)定酒曲糖化力［9］。試驗(yàn)結(jié)果表明，DNS法與碘量法檢測(cè)結(jié)果基本一致，與以其為糖化劑的黃酒出酒率一致，可快速測(cè)定，且操作簡(jiǎn)便。碘量法與DNS法均為紅曲米糖化酶適宜的檢測(cè)方法，兩方法檢測(cè)數(shù)據(jù)具有可比性、數(shù)據(jù)可信。從時(shí)效性考慮，碘量法適宜少量樣品測(cè)定，DNS法適宜用于快速測(cè)定多個(gè)樣品。斐林試劑法的原理是，利用糖化酶水解可溶性淀粉為葡萄糖，葡萄糖與斐林試劑反應(yīng)，將二價(jià)銅在堿性條件下還原成一價(jià)的銅，后者與黃血鹽生成不沉淀的絡(luò)合物．用次甲基藍(lán)為指示劑確定反應(yīng)終點(diǎn)［8］。斐林試劑法的影響因素很多，操作繁瑣、時(shí)間長(zhǎng)，試驗(yàn)結(jié)果表明，測(cè)定結(jié)果與碘量法、DNS法存在較大的差異。

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作者:林曉婕 梁璋成 黃飛 任香蕓 林曉姿 何志剛 單位:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所 福建省農(nóng)產(chǎn)品 （食品）加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室