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《廣東農業科學雜志》2015年第二十期

白蠟多年菌（Perenniporiafraxinea）是一種多孔菌科多年菌屬的珍稀食藥用真菌。野生白蠟多年菌在北京、安徽、湖南、廣東等地均有發現，多長于腐朽的樹上［1］。作為野生食藥用菌，它富含糖類活性物質，并具有較高的營養價值［2］。目前，國內外對白蠟多年菌進行的研究主要在其菌絲纖溶蛋白酶的分離純化及表征方面［3］，但關于白蠟多年菌液體培養條件的相關研究尚不多見。為此，本試驗研究白蠟多年菌液體培養的碳氮源及培養條件對其胞外多糖含量的影響，以期為白蠟多年菌的開發利用及其多糖的工業化生產提供建論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料供試菌株：白蠟多年菌（Perenniporiafraxinea）菌株，由華南師范大學生命科學學院提供。主要儀器與設備：2-16K通用臺式離心機（美國Sigma公司），UV2450紫外-可見分光光度儀（日本島津公司），pH計（北京時代新維測控設備有限公司）。

1.2試驗方法

1.2.1單因素及正交試驗以胞外多糖含量為指標，考察碳源（葡萄糖、麥芽糖、D-果糖、蔗糖、可溶性淀粉，濃度分別為25、30、35、40、45g/L）、氮源〔NH4NO3、（NH4）2SO4、尿素、KNO3、L-谷氨酰胺，氮原子含量為50mmol/L，濃度分別為0.5、1、2、4、8g/L〕、培養液初始pH（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）、裝液量（50、75、100、125、150mL/250mL）、溫度（18、21、24、27、30℃）、搖床轉速（120、150、180、210、240r/min）及培養時間（5、7、9、11、13d）對菌絲產胞外多糖的影響。在單因素試驗的基礎上，以正交試驗考察溫度、初始pH、裝液量、培養時間對白蠟多年菌液體培養產胞外多糖的影響，正交試驗設計見表1。上述各處理組試驗步驟為：將菌株轉接于母種培養基的培養皿內，制成平板菌種，用同一打孔器在平板菌種的同一半徑上打孔，將4個菌栓接入試驗培養基，置于搖床振蕩培養。

1.2.2指標測定將發酵液于8000r/min離心5min，棄沉淀，取上清液備用。總糖含量使用苯酚-硫酸法測定［4］；還原糖含量用二硝基水楊酸（DNS）法測定［5］；胞外多糖含量是總糖含量與還原糖含量之差［6］。試驗數據用SPSS13.0處理系統進行統計，采用LSD法（最小顯著性差異法）進行數據間的方差分析［7］。

2結果與分析

2.1碳源對菌絲產胞外多糖的影響從圖1可以看出，白蠟多年菌菌絲在5種不同碳源的液體培養基上都可產胞外多糖，但是其胞外多糖含量存在差異。以蔗糖作為碳源時，胞外多糖含量最高、達到47.56g/L，極顯著高于其他碳源。因此，白蠟多年菌菌絲產胞外多糖適宜碳源是蔗糖，這與前人對樺褐孔菌、靈芝等最適碳源的研究結果一致。由圖2可知，菌絲在蔗糖濃度25~45g/L范圍內均可產生胞外多糖，但其含量有一定差異。隨著蔗糖濃度的增高，胞外多糖含量逐漸升高，當蔗糖濃度為40g/L時，胞外多糖含量最高、為57.28g/L，極顯著高于其他濃度的胞外多糖含量。當蔗糖濃度為45g/L時，菌絲胞外多糖含量反而減少。可見蔗糖濃度過高或過低都會影響白蠟多年菌對碳素營養的吸收，導致胞外多糖含量降低。因此，最適宜白蠟多年菌產胞外多糖的蔗糖濃度為40g/L。

2.2不同氮源對菌絲產胞外多糖的影響由圖3可知，不同氮源培養基中胞外多糖含量由高至低順序為硝酸銨、硫酸銨、L-谷氨酰胺、尿素、硝酸鉀。菌絲體在以硝酸銨為氮源的培養基中胞外多糖含量最高、為65.48g/L，極顯著高于其他氮源培養基中的胞外多糖含量；當以硝酸鉀為氮源時，菌絲胞外多糖含量最少、僅有22.48g/L。因此，白蠟多年菌液體發酵產胞外多糖的適宜氮源為硝酸銨。從圖4可看出，當硝酸銨濃度小于1g/L時，菌絲胞外多糖的含量隨著濃度的增加而增加；當硝酸銨濃度為1g/L時，胞外多糖含量最高、達87.15g/L，高于其他濃度；當硝酸銨濃度大于1g/L時，胞外多糖含量隨著濃度的增加反而減少。可見，過量或過低的氮素營養不僅妨礙了菌絲對氮源本身的吸收，還影響了對其他營養物質的利用，影響了菌絲胞外多糖的產量。因此，為獲得更多的胞外多糖，菌絲液體培養基中硝酸銨濃度以1g/L為宜。

2.3不同初始pH值對菌絲產胞外多糖的影響由圖5可知，菌絲在初始pH為5.5~7.5范圍的培養基內均可產生胞外多糖，在初始pH為5.5時菌絲產胞外多糖少，隨著初始pH的增大，菌絲胞外多糖含量也不斷增加。當初始pH為6.5時，胞外多糖量達到最高值、為36.61g/L。隨著pH進一步升高，胞外多糖含量逐漸下降，當初始pH為7.5時，胞外多糖含量最少，僅有21.45g/L。因此，白蠟多年菌更適合在偏微酸性的環境中產生胞外多糖，最適初始pH為6.5。

2.4不同裝液量對菌絲產胞外多糖的影響由圖6可知，不同裝液量對于菌絲產胞外多糖有重要影響，隨著裝液量的增加，菌絲胞外多糖含量也逐漸增加，當裝液量為75mL/250mL時，菌絲產胞外多糖含量最多、為31.59g/L。但隨著裝液量的進一步增加，菌絲的胞外多糖含量急劇下降，當裝液量為125mL/250mL時，胞外多糖含量達最低值，僅有3.5g/L。這可能是過多裝液量影響培養液的氧量，導致菌絲生長不良而胞外多糖含量不高。因此，適于白蠟多年菌菌絲產胞外多糖的裝液量為75mL/250mL。

2.5不同轉速對菌絲產胞外多糖的影響從圖7可以看出，隨著轉速的增大，胞外多糖含量逐漸增加。當轉速為150r/min時，胞外多糖含量達到最大，為40.17g/L；但隨著轉速進一步增加，胞外多糖含量急劇下降，當轉速為240r/min時，胞外多糖含量最低，僅有9.58g/L。可見，強力機械振蕩會損傷細胞結構，也可能導致胞質營養交換過快，不利于菌絲生長及胞外多糖的分泌。因此，150r/min為白蠟多年菌菌絲產胞外多糖的適宜轉速。

2.6不同培養溫度對菌絲產胞外多糖的影響由圖8可知，在18~27℃的溫度范圍內，隨著溫度的升高，胞外多糖含量逐漸升高，在27℃培養時胞外多糖含量最高，達到54.94g/L；但當溫度超過27℃時，胞外多糖含量急劇下降，在30℃時胞外多糖含量僅有10.01g/L。溫度對菌絲生長和代謝作用的影響較大，菌絲產胞外多糖最適宜的培養溫度為27℃。

2.7不同培養時間對菌絲產胞外多糖的影響由圖9可知，培養時間是影響菌絲產胞外多糖的重要因子。隨著培養時間的增加，胞外多糖含量逐漸上升，培養9d后達到最大值，為31.46g/L。此后，隨著培養時間的延長，菌絲老化，菌絲的產胞外多糖量也逐漸下降。因此，為獲得較多的胞外多糖，培養時間以9d適宜。

2.8正交試驗溫度、起始pH、裝液量、培養時間對菌絲胞外多糖含量影響的正交試驗結果見表2。從表2的極差R可知，四因素對白蠟多年菌產胞外多糖的影響由大到小順序為初始pH＞溫度＞裝液量＞培養時間，極差計算所得的產胞外多糖量較優的組合為A3B1C3D2，即溫度27℃、起始pH5.5、裝液量125mL/250mL、培養9d。對本試驗確定的最佳培養條件組合進行試驗驗證，結果表明白蠟多年菌胞外多糖產量能維持在103.04g/L，比任一組正交試驗的胞外多糖含量都高。

3結論與討論

與菌絲固體培養相比，液體深層培養可以根據菌絲在生長過程中對碳源、氮源、生長因子等營養物質及溫度、pH值、需氧量等條件的不同需要，合理配制，補加各種營養物質和隨時調節溫度、pH值和通風量，這就有可能把微生物培養過程的生長、代謝都控制在最佳狀態而收到最好的培養效果。另外，與寄主培養、固體培養和代料栽培相比，白蠟多年菌液體培養是一種獲得其多糖產物較為方便的途徑，并且也比較容易對其培養條件進行優化及對其胞外多糖進行分離純化。目前大多數的菌絲發酵研究采用液體培養的方法。本試驗結果表明，白蠟多年菌的最適碳源為蔗糖，最適蔗糖濃度為40g/L，最適硝酸銨濃度為1g/L。由此可推知，該菌種適宜的碳氮比接近50∶1，這與前人對食用菌C/N值不大一致，這可能與菌種自身生理特性和培養的環境有關。在氮源試驗中，當以硝酸銨、硫酸銨以及L-谷氨酰胺為氮源時，白蠟多年菌的胞外多糖含量較高，可見白蠟多年菌更喜好在導致培養基酸化的銨鹽或酰胺鹽中發酵產糖。從培養條件來看，通過對比單因素試驗和正交試驗結果可知，pH值的適宜范圍為5.5~6.5。這符合前人對擔子菌屬的菌種生長探究中得出的擔子菌對pH值的要求比較廣泛的結論，但總體來說白蠟多年菌適合在偏微酸性的環境下生長。白靈菇在培養的第4天產胞外多糖量達到最大值，而生物量在第8天達到最大值。在本試驗中，白蠟多年菌生物量在第7天達到最大值，產胞外多糖量在第9天達到最大值。可見對于白蠟多年菌來說，菌絲體生長優先于產胞外多糖，這與白靈菇明顯不同。這說明白蠟多年菌的生長周期要比草菇菌和白靈菇長。有研究表明，多聚蛋白胨有利于灰樹花的菌絲體和胞外多糖的的生產，在本試驗中也發現同樣的規律，加少量蛋白胨的培養基更利于白蠟多年菌產胞外多糖和菌絲的生長。

作者：梁冬秋 張翔宇 張松 單位：華南師范大學生命科學學院