本站小編為你精心準(zhǔn)備了牛耳朵組培快繁體系的建立參考范文，愿這些范文能點(diǎn)燃您思維的火花，激發(fā)您的寫(xiě)作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

《貴州林業(yè)科技雜志》2016年第3期

摘要:

以當(dāng)年生長(zhǎng)良好的牛耳朵葉片為外植體，通過(guò)對(duì)外植體的消毒、不定芽誘導(dǎo)、增殖及生根培養(yǎng)，篩選高效穩(wěn)定的無(wú)菌芽誘導(dǎo)優(yōu)化體系。結(jié)果表明:外植體最佳消毒方法為用70%酒精浸泡30s，3%NaClO消毒2.0min;不定芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為:WPM+6－BA3.0mg/L+2－ip1.0mg/L+NAA0.1mg/L，誘導(dǎo)率為83.23%;不定芽增殖最佳培養(yǎng)基為MS+6－BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+GA30.5mg/L，增殖系數(shù)為16.0，且不定芽長(zhǎng)勢(shì)良好;生根培養(yǎng)基以1/2MS+IBA0.1mg/L+NAA0.05mg/L為較好，生根率達(dá)92.35%。以腐殖土:珍珠巖=3:1為移栽基質(zhì)的成活率最高達(dá)100%。

關(guān)鍵詞:

牛耳朵;芽誘導(dǎo);培養(yǎng)基

牛耳朵為苦苣苔科唇柱苣苔屬植物，根和全草入藥，其味甘、性平，具有補(bǔ)虛、止咳、解毒等藥用功效［1～4］。唇柱苣苔屬植物全世界約130種;其中約81種分布在我國(guó)的西南、華南向東達(dá)浙江、福建、臺(tái)灣，湖北、湖南、廣東、廣西、貴州、四川等地［2～6］。牛耳朵是多年生草本植物，花1～15朵，花序基部有苞葉，寬卵形或卵形，葉面被密毛。花冠管圓柱狀，呈紫色或淡紫色，花期4～7月。其在海拔400～1200米的石灰?guī)r山地或山溝邊林下生長(zhǎng)，適于疏松肥沃的酸性或微酸性土壤。牛耳朵葉四季常青，花期長(zhǎng)、花色艷麗，尤其是開(kāi)花前期花梗頂端苞片外緣呈紫紅色，作室內(nèi)盆栽觀賞效果佳;牛耳朵還可用于露地花壇、草坪及地被植物栽培，具有極高的園林景觀開(kāi)發(fā)前景，是一個(gè)正待開(kāi)發(fā)的觀賞植物［2～3］。目前，吳建璋等初步研究表明牛耳朵提取物對(duì)自發(fā)性高血壓有顯著的藥用功效，其作為藥用植物雖然尚未進(jìn)入開(kāi)發(fā)階段，但具有極大的開(kāi)發(fā)潛力。牛耳朵采用播種繁殖、扦插繁殖，繁殖速度慢，后代易產(chǎn)生遺傳變異。溫放［6］等對(duì)牛耳朵在組織培養(yǎng)方面進(jìn)行了研究，研究結(jié)果表明，不定芽的誘導(dǎo)率僅為73%，存在誘導(dǎo)率低、叢生芽增殖系數(shù)較低的缺點(diǎn)。本研究以牛耳朵葉片為外植體，對(duì)其無(wú)菌體系建立、不定芽誘導(dǎo)、繼代增殖、生根等一系列問(wèn)題進(jìn)行了研究，篩選各階段最佳培養(yǎng)基配方，建立牛耳朵芽誘導(dǎo)高頻植株體系。旨在為其標(biāo)準(zhǔn)規(guī)模化育苗提供技術(shù)理論支撐，對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐意義極為重要。

1材料與方法

1.1材料來(lái)源

供試材料為貴州省荔波茂蘭自然保護(hù)區(qū)的牛耳朵(ChiritaeburneanHanc)，以當(dāng)年生長(zhǎng)良好的葉片為外植體。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1外植體的消毒

將室外采集的葉片經(jīng)流水沖洗1h，先用70%酒精不同時(shí)間處理葉片，無(wú)菌水沖洗3～5次。再用3%NaClO消毒，3%NaClO消毒時(shí)間為2.0min、4.0min、6.0min和8.0min。滅菌后無(wú)菌水沖洗3～5次，接種在MS培養(yǎng)基上，添加蔗糖25g/L和瓊脂5g/L，調(diào)節(jié)pH值5.8;每瓶1個(gè)外植體，每一處理接種30瓶，培養(yǎng)溫度25±2℃，放置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，暗培養(yǎng)7d，然后轉(zhuǎn)移到光照強(qiáng)度1500～2000lx，每天光照12h，光照培養(yǎng)3d，觀察記錄污染數(shù)和成活數(shù)。萌發(fā)率(%)=腋芽萌發(fā)數(shù)/接種數(shù)(不包括污染數(shù))。

1.2.2誘導(dǎo)不定芽

將無(wú)菌外植體葉片切成0.5cm×0.5cm的小塊，轉(zhuǎn)接到添加不同濃度6－BA，2－ip和NAA的WPM培養(yǎng)基上，進(jìn)行葉片誘導(dǎo)不定芽的影響因子研究。當(dāng)6－BA濃度為3.0mg/L和NAA濃度為0.1mg/L，2－ip濃度為0.1，0.5，1.0，1.5，2.0和2.5mg/L6個(gè)濃度梯度，30d統(tǒng)計(jì)不定芽萌芽情況。每個(gè)處理30瓶，每個(gè)處理重復(fù)3次，放置在溫度25±2℃，光照強(qiáng)度1500～2000lx，每天光照12h的環(huán)境。叢生芽誘導(dǎo)率(%)=誘導(dǎo)出不定芽芽的腋芽數(shù)/接種的腋芽數(shù)。

1.2.3牛耳朵不定芽增殖

將葉片誘導(dǎo)的不定芽，接種到添加不同濃度的6－BA、NAA、GA3的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。30d統(tǒng)計(jì)不定芽增殖情況。每個(gè)處理30瓶，每個(gè)處理重復(fù)3次，放置于在溫度25±2℃，光照強(qiáng)度1500～2000lx，每天光照12h。增殖系數(shù)=誘導(dǎo)后不定芽的數(shù)/誘導(dǎo)前不定芽的數(shù)。

1.2.4牛耳朵不定芽生根

將不定芽切成單芽，接種在濃度為0.1mg/LIBA、0.05mg/LNAA、0.1mg/LIBA+0.05mg/LNAA和不加激素的1/2MS培養(yǎng)基上。每個(gè)處理接種30瓶，每個(gè)處理重復(fù)3次，放置于在溫度25±2℃，光照強(qiáng)度1500～2000lx，每天光照12h。觀察記錄生根情況并計(jì)算生根率。生根率=生根小苗數(shù)/總苗數(shù)×100%。

1.2.5煉苗與移栽

將生根組培苗揭開(kāi)瓶蓋，在室內(nèi)自然條件下煉苗7d;將苗移出培養(yǎng)瓶，用毛刷輕輕清洗根上的培養(yǎng)基。初步研究使用煉苗基質(zhì)為腐殖土、黃土、樹(shù)皮、珍珠巖4種，按不同配比，設(shè)置4個(gè)處理:I腐殖土;Ⅱ黃土;Ⅲ黃土:珍珠巖=3:1;Ⅳ腐殖土:珍珠巖=3:1。所用移栽基質(zhì)經(jīng)高錳酸鉀消毒，將苗移栽入基質(zhì)中，覆膜以及定期澆水保持空氣濕度，栽后30d統(tǒng)計(jì)苗成活率。

1.3數(shù)據(jù)處理方法

Excel2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理;SPSS19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同消毒處理對(duì)牛耳朵成活率的影響

消毒劑種類和消毒時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)外植體的影響較大，適宜的消毒劑和處理時(shí)間可有效降低污染數(shù)，減少組織污染死亡，提高外植體的成活率(表1)。結(jié)果表明70%酒精消毒時(shí)間30s+3%NaClO滅菌4min，污染率較低，成活率為57%;當(dāng)3%NaClO浸泡時(shí)間增加至6min，污染率和成活率都下降。因此采用70%酒精處理30s+3%NaClO浸泡4min的消毒滅菌，牛耳朵葉片外植體能得到較高的成活率和較低的污染率。

2.2不同濃度激素對(duì)葉片誘導(dǎo)不定芽的影響

牛耳朵接種于表2所示的培養(yǎng)基上培養(yǎng)45d左右形成一簇生芽﹙圖A﹚。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在前30d的培養(yǎng)過(guò)程中，芽分化和生長(zhǎng)速度較慢，但繼續(xù)培養(yǎng)25d后，叢生芽的誘導(dǎo)數(shù)量增多，生長(zhǎng)速度加快。在6－BA和NAA濃度一定，2－ip濃度在0.1～2.5mg/L之間變化時(shí)，葉片叢生芽的誘導(dǎo)率呈先上升后下降的趨勢(shì)，在1.0mg/L時(shí)，誘導(dǎo)率達(dá)到最高，為83.23%;NAA濃度保持不變時(shí)，低濃度的2－ip不利于無(wú)菌芽的分化，誘導(dǎo)率和平均發(fā)芽數(shù)隨著2－ip濃度的增加先升高后下降，在1.0mg/L時(shí)達(dá)到最高;而高于1.0mg/L時(shí)，玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重，誘導(dǎo)率反而下降。因此，在6－BA濃度3.0mg/L和NAA濃度為0.1mg/L時(shí)，2－ip濃度為1.0mg/L更適合誘導(dǎo)叢生芽，誘導(dǎo)率達(dá)到最高，為83.23%，平均萌芽數(shù)為15.32個(gè)。因此，葉片誘導(dǎo)叢生芽的最佳培養(yǎng)基為WPM+6－BA3.0mg/L+2－ip1.0mg/L+NAA0.1mg/L。

2.3不同濃度激素對(duì)不定芽增殖的影響

不同濃度激素對(duì)不定芽增殖的影響見(jiàn)表3。方差分析進(jìn)行多重比較:不同濃度激素處理對(duì)牛耳朵不定芽增殖有顯著差異。觀察發(fā)現(xiàn)6－BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+GA30.5mg/L為牛耳朵不定芽增殖最佳激素配比，分化不定芽較快，很快形成小植株，且數(shù)量多，部分分生出細(xì)根;無(wú)菌芽在該培養(yǎng)基上20天后開(kāi)始萌發(fā)，平均分化不定芽16.34個(gè)，在該組合培養(yǎng)基上，接種30天左右，分化的不定芽形成植株形態(tài)，具有3～4片葉片(圖B)。

2.4不同濃度激素處理對(duì)生根的影響

將有2～4片葉的無(wú)根苗轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基上，接種15d左右觀察有白色細(xì)長(zhǎng)的根發(fā)生﹙圖C﹚。對(duì)不同試驗(yàn)號(hào)進(jìn)行多重比較方差分析(表4)，結(jié)果顯示不同激素組合處理對(duì)牛耳朵生根的影響表現(xiàn)差異顯著。各處理的均值大小依次為4(92.35%)﹥3(82.30%)﹥2(52.12%)﹥1(32.18%);結(jié)果表明一定激素濃度的IBA和NAA組合對(duì)牛耳朵生根有促進(jìn)作用，誘導(dǎo)牛耳朵生根最佳組合為4號(hào)培養(yǎng)基，即:1/2MS+NAA0.05mg/L+IBA0.1mg/L，植株須根多，生長(zhǎng)良好，生根率平均可達(dá)92.35%。

2.5煉苗與移栽

經(jīng)過(guò)生根培養(yǎng)的組培苗，煉苗7d，使其適應(yīng)外界環(huán)境，移栽在已消毒的3:1的腐殖土:珍珠巖中，澆水，覆膜，70%的遮陽(yáng)網(wǎng)覆蓋遮陰。結(jié)果表明:8月移栽，30d后，移栽苗生長(zhǎng)良好，移栽成活率100%以上﹙圖D﹚，且正常開(kāi)花(圖E)。

3結(jié)論與討論

由于牛耳朵葉片上有短茸毛，在表面消毒時(shí)加大了滅菌的難度;在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，外植體消毒是關(guān)鍵一步。許多研究者采用升汞消毒，但是升汞消毒后難去除殘留的汞，本研究中采用當(dāng)年生長(zhǎng)良好的葉片，經(jīng)流水沖洗1h，先用70%酒精處理30s，再用3%NaClO消毒滅菌4min的方法，使無(wú)菌外植體成活率為57%，污染率降低為26.67%。不同類型植物對(duì)培養(yǎng)基具有選擇性，通常情況下草本植物用MS為基本培養(yǎng)基，WPM培養(yǎng)基用于木本植物。溫放［6～7］等對(duì)黃花牛耳朵、牛耳朵組織培養(yǎng)的研究結(jié)果表明:采用MS為基本培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率僅為73%，本研究用WPM為基本培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)不定芽，極大縮短誘導(dǎo)芽時(shí)間，同時(shí)增加不定芽的數(shù)量。因此，當(dāng)外植體難誘導(dǎo)不定芽的草本植物時(shí)可采用WPM培養(yǎng)基。合適的激素種類及濃度可有效促進(jìn)不定芽的誘導(dǎo)及增殖，牛耳朵葉片誘導(dǎo)不定芽的試驗(yàn)結(jié)果顯示，濃度為1.0mg/L的2－ip有利于芽誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率為83.23%。MS+6－BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+GA30.5mg/L明顯促進(jìn)不定芽的增殖。牛耳朵最適生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+NAA0.05mg/L+IBA0.1mg/L。適宜濃度的NAA和IBA對(duì)不定根的發(fā)生有明顯的促進(jìn)作用，生根率平均可達(dá)92.35%，且植株的葉片生長(zhǎng)健壯，長(zhǎng)勢(shì)良好。室外移栽時(shí)，牛耳朵組培苗對(duì)空氣相對(duì)濕度要求較高，移栽注意澆水保濕，移栽適宜基質(zhì)為腐殖土:珍珠巖=3︰1，成活率達(dá)100%以上。因此，本試驗(yàn)建立的牛耳朵組培快繁體系具有周期短、增殖系數(shù)大、成活率高等優(yōu)點(diǎn)，適合在生產(chǎn)上規(guī)模化推廣應(yīng)用。本研究?jī)H對(duì)牛耳朵芽誘導(dǎo)、增殖及生根快繁技術(shù)重要環(huán)節(jié)進(jìn)行了研究，但有關(guān)光照和溫度等環(huán)境條件在牛耳朵組培快繁的影響有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

［1］蔡祥海，鄧德山，馬云保，羅曉東.牛耳朵化學(xué)成分的研究［J］.中草藥，2005，36(4):510～511.

［2］羅揚(yáng)，鄧倫秀，楊成華等.貴州野生草本花卉［M］.貴州科技出版社，2009:38.

［3］李振宇，王印政.中國(guó)苦苣苔科植物［M］.河南科技出版社，2004:118～119.

［4］葛學(xué)軍.中國(guó)植物志［M］.科學(xué)出版社，2012:354～355.

［5］李振宇.苦苣苔亞科的地理分布［J］.植物分類學(xué)報(bào)，1996，34(4):341～360.

［6］溫放，李湛東，張啟翔.牛耳朵的離體培養(yǎng)和快速繁殖［J］.植物生理學(xué)通訊2006，42(5):906.

［7］溫放，張啟翔，任翔翔.黃花牛耳朵的離體培養(yǎng)和快速繁殖［J］.植物生理學(xué)通訊2008，44(2):301.

［8］王蓮輝，鄧龍玲，楊方成，等.非洲紫羅蘭的離體培養(yǎng)［J］.貴州林業(yè)科技，1999，27(3):54～55.

［9］陳黎.觀賞植物的組織培養(yǎng)繁殖技術(shù)研究綜述［J］.黃山學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，7(3):55～57.

［10］吳建璋，文永新，陳月圓等.牛耳朵乙醇提取物對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血壓和左心室肥厚的影響［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011，1(22):184～185.

［11］張祝麗，姜燕琴，於虹.烏飯樹(shù)芽誘導(dǎo)體系的建立［J］.北方園藝，2015，(17):79～82.

［12］趙先海，張曉明，鄧小梅等.‘金銀花3號(hào)’金銀花組培快繁技術(shù)［J］.林業(yè)科技開(kāi)發(fā)，2014，3(28):105～107.

作者:婁麗 李從瑞 侯娜 楊成華 鄧倫秀 單位:貴州省林業(yè)科學(xué)研究院