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《核農(nóng)學(xué)報(bào)》2016年第六期

摘要:

利用γ射線輻照水稻品種嘉浙B的種子，從處理后代中獲得了穩(wěn)定的類病斑突變體嘉浙DB。為了闡明該突變體性狀形成的遺傳和生物學(xué)基礎(chǔ)，開(kāi)展了突變基因定位和類病斑特征及葉綠體相關(guān)特性的研究。結(jié)果表明，嘉浙DB是一種典型的Sekiguchi類病斑突變體，在無(wú)病原菌侵染和外界脅迫的情況下，葉片上可自發(fā)形成棕黃色病斑，病斑的面積隨著植株的生長(zhǎng)不斷擴(kuò)大;在病斑擴(kuò)展階段，突變體葉片細(xì)胞中葉綠體結(jié)構(gòu)紊亂，提早降解，光合作用效率顯著下降;嘉浙DB的類病斑性狀屬隱性性狀，很可能受LOC_Os12g16720的1個(gè)突變等位基因控制，其第1425位核苷酸G缺失可導(dǎo)致移碼突變從而編碼一個(gè)截?cái)嗟牡鞍?突變體中清除活性氧的4個(gè)葉綠體抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)的基因轉(zhuǎn)錄水平在白天光合作用下均顯著高于野生型，而在夜間則無(wú)顯著差異。葉綠體的結(jié)構(gòu)紊亂及細(xì)胞內(nèi)的高活性氧含量可能是引發(fā)突變體葉片細(xì)胞凋亡的原因。本研究為從葉綠體的角度闡述Sekiguchi類病斑發(fā)生的分子機(jī)制提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞:

類病斑突變體;Sekiguchi;葉綠體;抗壞血酸過(guò)氧化物酶;細(xì)胞凋亡

在無(wú)病原菌侵染和逆境或損傷侵害時(shí)，植物葉片自發(fā)形成的與被病原菌侵染類似的壞死癥狀統(tǒng)稱為類病斑，根據(jù)病斑出現(xiàn)時(shí)間和是否擴(kuò)散，LM可分為起始型和擴(kuò)散型2類［1］。前者在葉片伸出葉鞘時(shí)就已帶有病斑，一般較小，多呈點(diǎn)狀;后者在葉片伸出葉鞘后才出現(xiàn)，斑點(diǎn)面積不斷擴(kuò)大，多為不規(guī)則形狀，最后斑點(diǎn)間可擴(kuò)展互連而使整張葉片枯死。目前，通過(guò)誘發(fā)突變已獲得了多種突變體，培育了大批優(yōu)良品種，在植物功能基因組學(xué)研究中發(fā)揮了重要作用［2－4］。LM突變是水稻中常見(jiàn)的一類突變體，斑點(diǎn)形狀各異［5－7］。其中，Segikuchi突變體是水稻中最早被發(fā)現(xiàn)的一類LM突變體，屬于擴(kuò)散型LM，可自發(fā)形成，且在接種稻瘟病病原菌或者化學(xué)試劑(過(guò)氧化氫)處理之后會(huì)提前出現(xiàn)［8－9］。同時(shí)SekiguchiLM是一種光依賴型類病斑，其形成需要光照誘導(dǎo)［10］。已克隆的水稻LM突變基因編碼不同功能的蛋白，如泛素介導(dǎo)蛋白降解相關(guān)蛋白［11］、網(wǎng)格蛋白受體［12］、RNA結(jié)合蛋白［13］、RNA選擇性剪接蛋白［14］。Fujiwara等［15］克隆得到控制Sekiguchi病斑的基因，該基因編碼細(xì)胞色素P450單加氧酶，可催化色胺轉(zhuǎn)化為五羥色胺。本研究在γ射線輻射誘變的群體中發(fā)現(xiàn)了1株類病斑突變體，經(jīng)多代繁殖形成了穩(wěn)定的LM突變系。之后將突變基因定位在1個(gè)包含Sekiguchi類病斑突變基因的區(qū)段，確認(rèn)基因CYP71A1出現(xiàn)了G缺失突變。在此基礎(chǔ)上，對(duì)其葉綠體結(jié)構(gòu)、光合作用特性和活性氧清除相關(guān)基因表達(dá)等開(kāi)展研究，分析突變體中葉綠體降解的特征及其在細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用，旨在為進(jìn)一步闡明類病斑發(fā)生的分子機(jī)制提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1LM突變體培育采用350Gy60Co－γ射線誘變處理干種子建立秈稻品種嘉浙B的突變?nèi)后w。γ射線輻照在浙江大學(xué)輻照中心完成，M1種植方法同李瑞清等［16］的報(bào)道。在成熟期的M2群體中(約20000株)發(fā)現(xiàn)了1株葉片出現(xiàn)不規(guī)則斑點(diǎn)的變異株。之后在M3和M4群體中繼續(xù)觀察到相同的類病斑性狀，群體內(nèi)不再分離，從而將其定名為嘉浙B大斑突變體，簡(jiǎn)稱嘉浙DB。在分蘗期，分別取嘉浙DB具大斑表型的葉片，與野生型葉片一起進(jìn)行胎盤藍(lán)染色。具體方法為:將葉片浸泡于染液中(30mL乙醇，10g苯酚，10mg胎盤藍(lán)，10mL乳酸，10mL甘油，10mL水)，煮沸2～3min，室溫放置2h。然后用2.5mg•mL－1水合氯醛脫色，并保存于50%甘油中。

1.2基因定位為定位大斑突變基因，用嘉浙DB與5個(gè)水稻品種(日本晴、浙粳122、嘉911、嘉33和協(xié)青早)雜交，F(xiàn)1自交得到F2群體。在分蘗期，選取攜帶大斑的單株采用CTAB法［16］從葉片中提取基因組DNA。參照Gramene網(wǎng)站相關(guān)信息選擇用于定位的微衛(wèi)星標(biāo)記;同時(shí)用洪雋等［17］的方法在定位區(qū)段內(nèi)設(shè)計(jì)插入/缺失標(biāo)記(InDel)，用于突變基因定位(表1)。采用20μLPCR反應(yīng)體系:2μL基因組DNA(約50ng)、上下游引物(10μmol•L－1)各0.5μL，2×TaqMix10μL，用ddH2O補(bǔ)足20μL。PCR程序設(shè)置為:94℃預(yù)變性90s;94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物在10%聚丙烯酰胺凝膠上分離，銀染法顯示DNA條帶［18］。

1.3葉片顯微結(jié)構(gòu)觀察和光合作用的測(cè)量從已經(jīng)出現(xiàn)LM的嘉浙DB植株中，選取3個(gè)不同發(fā)展階段的葉片進(jìn)行葉綠體顯微結(jié)構(gòu)的觀察，即尚未出現(xiàn)類病斑的葉片(L1)，出現(xiàn)病斑葉片中的非病斑區(qū)域(L2)和病斑區(qū)域(L3)。所取葉片在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定過(guò)夜，之后用0.1M磷酸緩沖液(pH值7.0)漂洗3次，每次15min，再用1%鋨酸處理1～2h，磷酸緩沖液清洗后依次用乙醇(50%、70%、80%、90%、95%、100%)梯度脫水，每次15min，最后用純丙酮處理20min。用樹(shù)脂包埋劑/丙酮(1∶1和3∶1)分別滲透處理1h和3h后，在純包埋劑中滲透過(guò)夜。樣品切成70～90nm薄片，用檸檬酸鉛和醋酸雙氧鈾各染色15min，在透射顯微鏡(HitachiH－7650，日本日立)下觀察超微結(jié)構(gòu)。在下午13點(diǎn)到14點(diǎn)間(光照強(qiáng)度約1000μmolE•m－2•s－1)用光合速率測(cè)定儀Yaxin－1101(北京雅欣理儀科技有限公司)測(cè)定嘉浙DB的3類病斑不同發(fā)展階段的葉片及對(duì)照嘉浙B的凈光合速率，蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度、細(xì)胞間CO2濃度。

1.4RNA的提取及實(shí)時(shí)定量PCR在分蘗期，取嘉浙B和嘉浙DB無(wú)斑點(diǎn)葉片組織，采用TRIzol試劑提取總RNA。經(jīng)DNe酶處理后，取500ngRNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒M-MLV(大連TaKaRa公司)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)4個(gè)葉綠體抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)基因轉(zhuǎn)錄本豐度進(jìn)行分析［19］。PCR體系為10μL，含1μLcDNA、0.4μL上下游引物(10μmol•L－1)、5μL2×Mix緩沖液(Mtermix，TOYOBO)，雙蒸水補(bǔ)足10μL。PCR程序?yàn)?94℃充分變性2min;94℃變性30s，60℃復(fù)性/延伸1min，40個(gè)循環(huán)。以管家基因Actin2(LOC_Os19g36650)作為內(nèi)參基因(表2)，采取2－ΔΔCt方法分析相對(duì)表達(dá)量［20］。

1.5數(shù)據(jù)分析利用軟件StatView對(duì)光合作用及RT-PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行方差(ANOVA)分析，檢測(cè)差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1類病斑突變體嘉浙DB的主要特征在幼苗階段(約萌發(fā)后6周內(nèi))，嘉浙DB葉片與野生型嘉浙B表現(xiàn)一致，未出現(xiàn)明顯的類病斑。但從分蘗期開(kāi)始，嘉浙DB完全伸展葉后出現(xiàn)類病斑，隨后病斑擴(kuò)大逐步形成不規(guī)則的形狀(圖1－A左)。斑點(diǎn)從小到大，至15d時(shí)大小已達(dá)0.8×1.5cm左右。最后，類病斑相互連在一起直至覆蓋整個(gè)葉片，類似枯葉，肉眼可見(jiàn)其大小的變化進(jìn)程(圖1－B)，長(zhǎng)度可達(dá)約1.5cm，寬度約0.9cm。通過(guò)胎盤藍(lán)染色，斑點(diǎn)區(qū)域被染上深重的顏色，染色區(qū)域的大小和形狀與葉片上的病斑區(qū)域一致，說(shuō)明斑點(diǎn)區(qū)域的細(xì)胞已經(jīng)死亡(圖1－A右)。由于病斑總是在葉片完全伸出后才形成，植株可以正常生殖生長(zhǎng)，在植株衰老死亡之前，一定數(shù)量的種子已經(jīng)成熟，因此不影響突變體的傳代。

2.2類病斑基因定位與分析在嘉浙B和嘉浙DB的雜交F2群體中，葉片出現(xiàn)類病斑與葉片正常植株分別是48株和152株，符合1∶3的分離比(χ2=0.16)，表明嘉浙DB的LM性狀由單隱性基因控制。為了克隆此突變基因，用F2群體中鑒定出來(lái)的1685個(gè)突變型單株進(jìn)行基因定位。首先利用微衛(wèi)星標(biāo)記將突變基因定位在第12號(hào)染色體上，介于RM101和RM1795之間;在這2個(gè)位點(diǎn)上分別有7個(gè)和6個(gè)單株表現(xiàn)為雜合型(圖2－A)。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用InDel標(biāo)記縮小范圍，將其限定在標(biāo)記ID22和ID18間約300kb區(qū)段內(nèi)(圖2－B)。根據(jù)Gramene網(wǎng)站信息，在這一區(qū)域內(nèi)共有58個(gè)基因。除LOC_Os12g16720外，有38個(gè)基因注釋為轉(zhuǎn)座子或者反轉(zhuǎn)座子基因，其它19個(gè)編碼蛋白的基因中，有9個(gè)功能未知的蛋白，其余10個(gè)基因編碼功能蛋白(表3)。其中，LOC_Os12g16720編碼細(xì)胞色素P450蛋白CYP71A1，該基因的突變已被確認(rèn)為導(dǎo)致了Sekiguchi突變表型［12］。最后將該基因和其它3個(gè)候選基因(LOC_Os12g16650，LOC_Os12g16690，LOC_Os12g17090)的全長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果表明，嘉浙B和嘉浙DB只在基因LOC_Os12g16720存在差異，突變體的第1425位核苷酸G缺失，理論上將造成移碼突變，而其它3個(gè)基因的序列完全一致(圖2－C)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞色素P450蛋白存在一個(gè)與卟啉環(huán)結(jié)合的結(jié)構(gòu)域核心保守序列FGGGRRGCPG，而1425G缺失引起的移碼突變恰能使這一結(jié)構(gòu)域丟失，從而使蛋白失去功能(圖2－D)。

2.3大斑突變對(duì)葉綠體結(jié)構(gòu)和光合作用的影響用透射電鏡對(duì)突變體葉片的3種組織(L1、L2、L3)進(jìn)行觀察，以探究嘉浙DB中葉綠體超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明，野生型植株嘉浙B葉片組織中可見(jiàn)完整的、平行排列的基粒類囊體，基粒之間的基質(zhì)類囊體也清晰可見(jiàn)(圖3－A、E)，而嘉浙DB葉片組織中，L1基粒已經(jīng)開(kāi)始降解，呈圓形，有嗜鋨顆粒出現(xiàn)，表明類囊體片層開(kāi)始降解(圖3－B、F)。L2基粒的整齊平行排列性消失，輪廓模糊(圖3－C、G)，同時(shí)出現(xiàn)了溶酶體和一些囊泡小球。L3細(xì)胞已處于混亂狀態(tài)，無(wú)明顯的細(xì)胞器，細(xì)胞結(jié)構(gòu)區(qū)室化消失，即整個(gè)細(xì)胞完全降解，只剩下細(xì)胞壁(圖3－D、G)。為了進(jìn)一步分析葉綠體的破壞是否會(huì)對(duì)光合作用造成影響，分別測(cè)定了嘉浙B和嘉浙DB葉片的4個(gè)光合作用相關(guān)參數(shù):凈光合速率(Pn)，蒸騰速率(Tr)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、細(xì)胞間CO2濃度(Ci)。由圖4可知，與嘉浙B相比，嘉浙DB的葉片組織Pn、Tr和Gs都顯著下降，表明類病斑突變對(duì)葉片光合作用具有顯著的負(fù)效應(yīng)。此外，突變體的Ci顯著高于野生型親本，表明CO2在突變體組織中不能被有效同化。在突變體中，L2的光合作用均低于L1，但差異不顯著，表明兩者的內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，具有漸進(jìn)性。2.4清除活性氧相關(guān)基因的表達(dá)為了探明嘉浙DB中葉綠體提早降解是否與活性氧過(guò)量有關(guān)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了4個(gè)葉綠體抗壞血酸過(guò)氧化物酶APX基因的表達(dá)水平。與嘉浙B相比，嘉浙DB的APX基因的轉(zhuǎn)錄水平在白天顯著提高，而在夜間兩者無(wú)差異(圖5)。

3討論

類病斑是一類常見(jiàn)的突變性狀，由于其在植物細(xì)胞程序性死亡、超敏反應(yīng)等在生物學(xué)研究中具有獨(dú)特的利用價(jià)值，該類材料的鑒定和研究一直受到高度重視［21－23］。Fujiawara等［15］曾用EMS誘變獲得3個(gè)表型與嘉浙DB相似的類病斑突變體，發(fā)現(xiàn)其分別由LOC_Os12g16720基因的3個(gè)突變［G1009A(發(fā)生在內(nèi)含子區(qū)域，影響基因表達(dá))，C1037T(Thr314Ile)和G1556A(Gly455p)］造成。本研究通過(guò)γ射線誘變處理育成了一個(gè)Sekiguchi類病斑突變體，基因定位和候選基因分析結(jié)果表明，該突變性狀有可能為CYP71A1基因突變所致。由于嘉浙DB突變可使蛋白的保守結(jié)構(gòu)域消失，因此是一份研究CYP71A1及其生物學(xué)功能的新的突變體材料。一般認(rèn)為，線粒體在PCD中發(fā)揮著重要的作用，可以因?yàn)槟る娢坏淖兓⒓?xì)胞色素c的釋放等原因引發(fā)細(xì)胞質(zhì)凋亡酶等下游一系列反應(yīng)，從而促進(jìn)PCD的發(fā)生［24－25］。在葉綠體光合作用過(guò)程中也可以產(chǎn)生大量活性氧(ROS)，它們?nèi)绻谌~綠體中不能被有效分解，將會(huì)破壞脂類物質(zhì)和蛋白質(zhì)，造成細(xì)胞衰老甚至引起細(xì)胞的死亡［26－28］。與呼吸作用電子傳遞鏈一樣，在葉綠體中也存在光合電子傳遞鏈，存在著細(xì)胞色素f，因此也可能介導(dǎo)植物發(fā)生PCD［29－30］。已經(jīng)明確一些類病斑突變體由于葉綠素代謝上存在缺陷可以引起胞凋亡，例如ACD1/ACD2，分別編碼脫鎂葉綠素酸氧化酶和葉紅素還原酶，它們的突變導(dǎo)致葉綠素代謝障礙，從而引起細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)系統(tǒng)的紊亂［31－32］。雖然已知Sekiguchi類突變體也表現(xiàn)為典型的PCD癥狀，但對(duì)引起的原因迄今尚不十分清楚。在本研究中，4個(gè)APX基因的轉(zhuǎn)錄水平在白天顯著高于嘉浙B，表明突變體中的ROS含量很高，因此有可能會(huì)促使PCD的發(fā)生。此外，從葉綠體的電鏡照片可以看出，突變體的葉綠體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了損壞，發(fā)現(xiàn)了溶酶體和一些囊泡小球，這些囊泡小球有可能用于運(yùn)輸葉綠體分解物質(zhì)，尤其是核酮糖羧化酶，而它們也是細(xì)胞死亡的一個(gè)重要標(biāo)志［33－34］。通過(guò)亞細(xì)胞定位，已經(jīng)明確CYP71A1是一個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白［12］，從而排除了由于其缺失直接引起葉綠體結(jié)構(gòu)紊亂的可能性。因此，葉綠體結(jié)構(gòu)的損壞更有可能是ROS不能及時(shí)清除造成的。此外，盡管突變體植株L1組織部位和野生型葉片都表現(xiàn)為綠色無(wú)病斑，但前者的光合速率顯著低于后者，說(shuō)明其葉綠體結(jié)構(gòu)受到損傷，從而影響光合作用。

4結(jié)論

本研究獲得了一份Sekiguchi類病斑突變體嘉浙DB，由編碼細(xì)胞色素氧化酶CYP71A1的基因LOC_Os12g16720發(fā)生缺失突變引起。該突變體葉綠體結(jié)構(gòu)紊亂，葉綠體提前分解，光合作用下降。編碼APX酶的基因轉(zhuǎn)錄水平顯著提高，表明突變體無(wú)法及時(shí)清除葉綠體產(chǎn)生的大量活性氧，從而造成PCD的發(fā)生。

作者：蘆海平 張華麗 富昊偉 李友發(fā) 崔海瑞 舒慶堯 單位：浙江大學(xué)原子核農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/農(nóng)業(yè)部核農(nóng)學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室 嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 浙江大學(xué)作物科學(xué)研究所