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摘要：采用不同濃度的槲皮素（QCT）交聯改性脫細胞豬真皮基質（pADM），并對改性后的脫細胞豬真皮基質（QCT-pADM）材料進行傅里葉紅外光譜、DSC、TG、表面形貌和耐降解性能等表征。結果顯示，槲皮素的引入不會改變pADM中膠原的三股螺旋結構；改性后脫細胞豬真皮基質材料纖維編織更為緊實，熱穩定性能得到提升，耐酶解性能和親水性能大幅提高。

關鍵詞：槲皮素；脫細胞豬真皮基質；交聯

前言

脫細胞豬真皮基質（Porcineacellulardermalmatrix，pADM）是通過物理、化學、生物學等方法將豬真皮組織去除皮內具有免疫原性的全部細胞成分后得到的一種膠原材料，其保留了組織中的膠原（纖維）成分和組織基本結構且具有三維空間結構。pADM具有良好的生物相容性、可促進細胞生長繁殖、生物降解性優良等特點，在生物醫學材料領域獲得日益廣泛的應用，但力學性能不足、耐降解性能差等缺點限制了其發展。因此，對pADM的適當改性尤為重要。化學交聯可在一定程度上封閉pADM的抗原位點，降低pADM的免疫原性，常用的化學交聯劑有戊二醛、碳化二亞胺、環氧化合物、京尼平等[1-3]。然而，化學交聯劑可能因為反應不完全或純度不夠而向材料中引入一定的雜質使得材料生物相容性下降。天然的提取產物可避免化學交聯劑毒性較大等問題。肖世維等[4]采用原花青素對pADM進行交聯，交聯后材料的機械力學性能增強，熱變性溫度升高，親水性能增加，同時材料無明顯急性毒性。槲皮素（Quercetin，QCT）是一種類黃酮醇，微溶于水，溶于乙醇、冰醋酸等溶劑中，以糖苷形式存在于蔬菜、瓜果等植物中。槲皮素獨特的分子結構使其具有多面的藥理功能和生物活性，具有抗菌消炎作用、抗氧化作用、抗腫瘤作用等[5]。槲皮素與原花青素分子結構類似，僅在4位多1個O原子（羰基O），具有鄰苯二酚、間苯二酚結構。呂昔琴等[6]采用槲皮素對心臟瓣膜進行交聯改性，改性的材料力學性能得到明顯提升，耐酶降解性能和細胞相容性提高，同時材料具有很強的抗鈣化能力。但以槲皮素作為天然交聯劑交聯pADM還未有報道。本文主要采用不同濃度的槲皮素對脫細胞豬真皮基質進行交聯改性，旨在了解槲皮素對pADM結構和性能的影響，以探討槲皮素作為pADM交聯劑的可能性。

1試驗部分

1.1主要儀器及試劑

1.1.1主要儀器精密分析天平（FA2004N），上海菁海儀器有限公司；冷凍干燥機（Freeze6），Labconco公司；萬能電子拉力機（GT-AL-7000S），高鐵檢測儀器有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀（NicoletIS10），美國ThermoScientific；差示掃描量熱儀（DSC-200PCPHOX），Netzsch公司；掃描電子顯微鏡（S3000N），Hitachi公司；熱重分析儀（TG209F1），Netzsch公司；超聲波清洗器（KH5200DE），昆山禾創超聲儀器有限公司。

1.1.2主要試劑脫細胞豬真皮基質，江陰奔翔生物科技有限公司；槲皮素，BR，國藥集團化學試劑有限公司；茶樹油，BR，國藥集團化學試劑有限公司；I型膠原酶，BR，賽默飛世爾生物化學制品有限公司；其他試劑均為分析純，成都科龍化工試劑廠提供。

1.2試驗方法

1.2.1QCT-pADM材料制備準確稱取400mg槲皮素（QCT）溶解于20mL無水乙醇中，超聲15min，得到均一溶液；然后用無水乙醇分別配制成1、2.5、5、10和20mg/mL溶液；準確稱取2g脫細胞豬真皮基質（pADM）分別浸在QCT溶液中，在37℃、持續搖動的條件下（r/min=120）進行交聯24h；反應結束后，將其用蒸餾水清洗5次后，冷凍干燥，制得QCT-pADM材料。1.2.2QCT-pADM材料性能表征

1.2.2.1傅里葉變換紅外分析分別刮取少量QCT-pADM纖維，與適量KBr共混，研磨均勻后壓片，在傅里葉變換紅外光譜分析儀上進行掃描。掃描條件為：4000~400cm-1范圍內掃描32次，分辨率4cm-1，檢測環境25℃，相對濕度±65%。

1.2.2.2熱變性溫度測定采用差示掃描量熱分析儀（DSC）檢測了脫細胞豬真皮基質在槲皮素處理前后的熱變性溫度。分別取膠原樣品3～5mg，密封于DSC坩堝中，以空坩堝作參比，用氮氣作樣品室保護氣，從10℃加熱到120℃，升溫速度為10℃/min[7]。

1.2.2.3熱重分析分別稱取質量2~5mg的QCT-pADM，于熱重分析儀上進行檢測，記錄質量隨溫度的變化。檢測溫度范圍50~800℃，升溫速率20k/min，氮氣保護60mL/min。1.2.2.4表面形貌觀察取一定量的QCT-pADM樣品，將其浸入液氮后折斷，對斷面和表面噴金處理，置于掃描電鏡下，在加速電壓20kV的條件下，放大不同倍數觀察。

1.2.2.5耐酶解性能測試干燥后的QCT-pADM材料裁剪為正方形，稱重（W1），將其加入含5U/mL、5mL膠原酶/PBS溶液的比色管中，在37℃的搖床中降解，隔天換降解酶液。樣品在特定的時間點被取出用蒸餾水清洗5次后，凍干稱量（W2）。降解速率用以下公式計算：降解速率（%）=[(W1-W2)/W2]×100%。

1.2.2.6接觸角檢測采用視頻接觸角測定儀對膜材料進行表面親疏水性檢測，將5μL煮沸冷卻的蒸餾水緩慢地滴在樣品表面，記錄液滴與膜材料接觸瞬間的圖像，然后計算接觸角，每個膜材料至少測定5個不同的表面區域，結果取平均值。

2結果與討論

2.1QCT-pADM傅里葉變換紅外分析紅外光譜特征酰胺吸收峰可直接反映天然I型膠原特殊的三股螺旋構象。1650cm-1處為膠原的酰胺I帶的吸收峰，歸因于膠原分子中的C=O伸縮振動；1545cm-1處為膠原酰胺II帶的吸收峰，歸因于N-H的彎曲振動和C—N的伸縮振動耦合作用，膠原的酰胺I、II帶與其二級結構中的α螺旋、β折疊和無規則卷曲結構直接相關[8]。1235cm-1左右處的吸收峰為酰胺III帶，歸因于N—H的面內彎曲振動和酰胺鍵內C—N拉伸，以及主鏈—CH2基團和側鏈的甘氨酸和脯氨酸擺動振動協同產生的吸收峰[9]，酰胺I帶、酰胺II帶和酰胺III帶可直接反映膠原分子內部的有序性。在3410cm-1的酰胺A帶和3082cm-1的酰胺B帶兩個吸收帶歸因于N—H基團的伸縮振動[10]。圖1是QCT-pADM材料的FT-IR圖。如圖1所示，經不同濃度QCT改性的pADM材料的酰胺帶吸收峰幾乎未發生變化，說明膠原骨架的三股螺旋結構并未發生改變。

2.2差式掃描量熱（DSC）分析圖2為不同濃度QCT改性pADM材料的DSC圖。圖譜中位于20~40℃之間的小峰稱為預變性峰，代表膠原分子結構出現一定程度的松弛，從螺旋結構轉變為無規卷曲結構的一個預先轉變狀態[11]。60~85℃之間的峰則為膠原的熱變性溫度峰，此時膠原結構發生不可逆轉的轉變，其三股螺旋結構遭到破壞。由圖可見，未經改性時pADM的熱變性溫度為65.7℃，QCT質量濃度為1、2.5、5、10、20mg/mL時，材料的熱變性溫度分別為73.8、75.9、78.6、81.2、83.3℃。由此可見，隨著QCT濃度增加，QCT-pADM材料的熱變性溫度也得以提升。可能的原因是QCT結構中含有的鄰苯二酚結構可與膠原的氨基、羥基等官能團發生較強的氫鍵結合，約束了膠原肽鏈之間的活動，使材料發生相轉變的難度逐漸增大。因此QCT-pADM材料的熱變性溫度升高，濕熱穩定性也隨之提升。

2.3熱重（TG）分析TG可用來表征材料在升溫過程中的失重現象，為進一步研究QCT-pADM材料的熱穩定性，對材料進行了熱重分析。一般而言，在50~150℃范圍內，主要發生膠原分子內氫鍵的斷裂，由膠原纖維內的水分揮發或雜質分解引起質量損失，在200~800℃范圍內，膠原三股螺旋結構與多肽鏈骨架被破壞[12]。圖3為不同用量交聯的QCT-pADM的熱重曲線。由圖3可見，各組樣品均具有相同的失重現象。隨著QCT用量增加，材料的殘留質量亦呈現出增加趨勢。不同QCT用量交聯的QCT-pADM的熱重曲線的一次微分曲線。通常認為，微分曲線的峰值為材料質量損失最快時的熱分解溫度。由圖4可見，隨著QCT用量的增加，QCT-pADM材料的微分曲線峰值均向較高溫方向移動。可能的原因是QCT結構中含有的鄰苯二酚結構可與膠原的氨基、羥基等官能團發生較強的氫鍵結合，約束了膠原肽鏈之間的活動，使材料發生相轉變的難度逐漸增大，因此使得材料的熱穩定性升高。TG分析結果與DSC熱變性溫度結果一致，說明QCT與pADM的交聯能提高材料的結構穩定性。

2.4表面形貌觀察pADM的主要成分為I型膠原。正如所知，pADM是一種由膠原分子、膠原原纖維、膠原纖維、膠原纖維束逐級構成的一種多層級膠原聚集體，纖維之間存在許多無規則的間隙。交聯會在膠原分子及纖維間形成新的化學鍵，將膠原纖維拉緊，使得材料輕微收縮，結構變得緊實。天然pADM材料存在個體差異，無法切實確定材料交聯前后的空隙變化情況。圖5為不同QCT用量交聯的QCT-pADM掃描電子顯微鏡圖像。pADM內膠原纖維束層層堆疊、交織在一起，縱橫交錯，纖維孔隙明顯。圖6為經不同用量QCT交聯后pADM的高倍SEM觀察圖。隨著QCT用量增加，pADM膠原纖維間隙逐漸變小，材料變得更加緊實。可見，QCT對pADM的交聯效果明顯，這也是QCT-pADM材料熱變性溫度得以提升的一個佐證，亦可根據需要選擇槲皮素用量，達到所需的交聯程度。

2.5耐酶解性能測試脫細胞豬真皮基質的體外耐酶解性能較差，因此對交聯后QCT-pADM材料的耐酶解穩定性檢測尤為重要。pADM的主要成分為I型膠原，故選擇I型膠原酶對QCT-pADM進行降解以表征其降解能力[13]。如圖7所示，脫細胞豬真皮基質在1天的降解率為80%，2天后接近完全降解。經1、2.5、5、10、20mg/mLQCT溶液交聯后的材料在酶液作用2天后降解率分別為20.10%、6.78%、6.77%、7.61%、7.06%；10天后降解率分別為73.71%、30.67%、25.86%、21.35%、18.23%。20天后經1mg/mLQCT溶液交聯后的材料接近完全降解，經2.5、5、10、20mg/mLQCT溶液交聯后的材料降解率分別為35.44%、28.75%、23.43%、20.70%。28天后，2.5mg/mLQCT溶液交聯后的材料降解率接近40%，最高濃度20mg/mLQCT溶液交聯后的材料降解率低于30%。由此可見，使用QCT交聯pADM可大幅提高材料的耐酶降解性能，且隨著QCT用量增加，pADM的耐酶解性能增強。材料抗酶解能力的提高可能得益于QCT結構中的鄰苯二酚結構與pADM內膠原分子內和分子間以及微纖維間形成交聯與氫鍵，使得材料結構更緊密，從而使其結構穩定性大幅增強，耐酶解性能大幅提高。

2.6接觸角測試生物醫用材料的表面親疏水性能對其與組織和細胞之間的相互作用具有重要影響，良好的親水性能更有利于細胞在材料表面的粘附和增殖[14]。材料表面的接觸角（watercontactangle，WCA）測試可以直觀反映材料的親疏水性能，材料的WCA值以90°為界限，高于90°為疏水型材料，低于90°為親水型材料，并且WCA值越低，材料的親水性越好。為了表征QCT-pADM材料表面的親疏水性能，本實驗采用視頻接觸角測定儀檢測了材料的接觸角。由圖8可知，未經改性的pADM材料的接觸角為113.8°，親水性較差，可能的原因是pADM是膠原聚集體，結構與膠原分子相較更封閉，暴露的親水基團較少。而經過不同濃度QCT溶液改性后，pADM材料表面的接觸角逐漸降低，且隨著QCT濃度升高而降低。說明隨著QCT濃度升高，材料的親水性越來越好。分析原因，一方面可能是QCT分子中含有鄰苯羥基、間苯羥基、醚鍵等親水基團，pADM經QCT改性后，QCT接到了膠原纖維上，QCT分子中含有的親水基團也引入到了pADM中，從而導致WCA降低，提高了材料表面的親水性。另一方面，由Wenzel方程可知，當接觸角小于90°時候，固體表面的粗糙因子越大，接觸角就越小，表面親水性也就越高[15-16]。

3結論

本文用不同濃度的QCT溶液（1mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL和20mg/mL）對純pADM材料進行改性，研究了槲皮素（QCT）對脫細胞豬真皮基質（pADM）結構和性能的影響。表征結果表明QCT與pADM之間的交聯作用對pADM的特征三股螺旋結構影響很小，pADM膠原纖維間隙逐漸變小，材料變得更加緊實。同時，QCT改性pADM使其熱力學性能、耐酶解性能和親水性能顯著提升。可見，槲皮素可以作為脫細胞豬真皮基質的一種新的交聯劑。

作者：龔居霞1,2；但衛華1,2；但年華1,2 單位：1.四川大學皮革化學與工程教育部重點實驗室，2.四川大學生物醫學工程技術研究中心