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摘要：目的：進行大蒜廢水抑菌活性和穩定性初步研究，為天然資源的開發利用提供理論依據，降低大蒜廢水的污染。方法：利用微量稀釋法對蒜片加工廢水對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及耐藥菌株的抑菌活性進行檢測。結果：當培養基中含有2.5%~3%濃度的大蒜廢水時，能夠明顯抑制大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和耐藥菌株的生長；并且大蒜廢水經過70℃處理或者常溫放置5d后仍能保持抑菌活性。結論：大蒜廢水能夠代替抗生素作為家禽飼料的添加劑，抑制常見微生物菌株和一些具有耐藥性菌株，避免家禽感染疾病，同時實現大蒜廢水的資源利用，減少污染。大蒜(Garlic)又名胡蒜、葫，為百合科蔥屬植物[1]。是一種常見的、非常受歡迎的香料，且具有多種治療作用[2]。最早在古埃及、古羅馬和古希臘等地中海沿岸國家栽培。公元前100多年，大蒜由張騫從西域引入關中地區,后來逐步遍及全國。目前，中國已經成為全世界大蒜產量最高的國家[3]。大蒜已經成為人們日常生活的不可或缺的重要蔬菜類食物，在食品的加工過程中作為重要的輔助材料提升食物的風味。近年來，大蒜由于其良好的抗菌、消炎、炎、健胃、止咳、祛痰等功用而被深入研究，揭示了大蒜中含有大量的大蒜辣素(Allicin)而成為一種植物來源的天然抗菌劑[4-7]，展現出良好的保健作用。但在蒜片片加工過程中，要用水對切片機的刀片進行連續的沖洗，以確保切片機的正常運行，每年高達上千萬t的蒜片加工廢水因此而形成，而大蒜廢水由于具有大蒜辣素而使得處理工序復雜，且易造成嚴重的環境污染，能否對大量的蒜片加工廢水實現有效利用，避免廢水中大蒜辣素的浪費，值得引起足夠的重視。另外一方面，近年來，隨著人們對養殖業持續低水平飼喂抗生素而造成的對人類健康的危害[8-10]，如細菌耐藥、畜產品藥物殘留、過敏中毒反應以及“致畸致癌致突變”作用等的等的認識的不斷加深，越來越多的國家開始采取措施禁止在畜牧養殖產業中使用抗生素，如果大蒜廢水能夠表現出明顯的抑菌活性，進而可以作為抗生素替代品用于養殖業。本研究中，以大蒜廢水作為研究對象，就蒜片加工廢水的抑菌活性進行了研究，同時也對蒜片加工廢水作為抗生素替代品在熱穩定性及存放時間的特性進行了研究。發現蒜片加工廢水具有很好的抑菌作用，不僅可以抑制普通菌株，如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等，而且可以抑制耐藥菌株，如金黃色葡萄球菌(ATCC43300，ATCC6538和CMCC(B)2600)和表皮葡萄球菌ATCC35764等，同時也對其大蒜辣素的含量進行了測定，為蒜片加工廢水的資源化開發利用展現了很好的應用前景。

1材料與方法

1.1材料與儀器

大蒜白皮蒜，山東金鄉；胰蛋白胨英國oxoid公司；酵母提取物英國oxoid公司；氯化鈉國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂粉國藥集團化學試劑有限公司；L-半胱氨酸阿拉丁試劑（上海）有限公司；三羥甲基氨基甲烷西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；去離子水實驗室制備。普通菌株：金黃色葡萄球菌；大腸桿菌；枯草芽孢桿菌各1株均由江南大學藥學院微生物實驗室提供；耐藥菌株：金黃色葡萄球菌(ATCC43300，ATCC6538和CMCC(B)2600)及表皮葡萄球菌(ATCC35764)由無錫市疾病控制與預防中心提供)。SW-CJ-1FD潔凈工作臺蘇州安泰空氣技術有限公司；BXM30R滅菌鍋上海博迅實業有限公司；EppendorfResearchplus移液器艾本德中國有限公司；BPH-9052恒溫培養箱冠森生物科技（上海）有限公司；DZF-6050數顯鼓風干燥箱林茂科技（北京）有限公司；申科R-201旋轉蒸發器無錫市申科儀器廠；HHCJ-4C恒溫水浴鍋常州諾基儀器有限公司；SHB-шA循環水式多用真空泵鄭州長城科工貿有限公司；ZF-20A暗箱四用紫外分析儀上海驥輝科學分析儀器有限公司；T6系列紫外分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司；九陽切片機九陽股份有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1反應試劑配制Tris-HCl緩沖液（pH7.5,50mmol/L）：精密稱取1.5000gTris（三羥甲基氨基甲烷），適量去離子水溶解，調節pH7.5，轉移至250mL容量瓶中并定容至刻度；半胱氨酸（10mmol/L）：精密稱取0.0030gL-半胱氨酸，適量50mmol/LTris-HCl緩沖液（pH7.5）溶解，轉移至50mL棕色容量瓶中，并定容至刻度；DTNB（1.0mmol/L）：精密稱取0.0198gDTNB（5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)），適量50mmol/LTris-HCl緩沖液（pH7.5）溶解，轉移至50mL容量瓶中，并定容至刻度。

1.2.2大蒜廢水制備稱蒜瓣30g，去皮用切片機切片，將蒜片收集在燒杯中并用少量水將切片機沖洗干凈。向燒杯中添加去離子水至60mL，然后置室溫(<20℃)下浸泡2h。四層紗布過濾，濾液置4℃冰箱避光保存，作為大蒜廢水原液待用，并利用分光光度計方法[11-12]測定大蒜廢水原液中大蒜辣素的含量。

1.2.3菌懸液的制備將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌以及耐藥菌株ATCC43300、ATCC6538、CMCC(B)2600和ATCC35764分別接種于營養瓊脂斜面，37℃培養24h，然后分別用10mL生理鹽水將各個斜面細胞洗下制成菌懸液，將菌懸液用無菌生理鹽水稀釋至106CFU/mL，備用。

1.2.4大蒜廢水對普通菌株的最小抑菌濃度的測定將大蒜廢水原液用去離子水稀釋成不同濃度的溶液，按照培養基:溶液=9:1(v/v)的配比配制含不同濃度大蒜廢水的營養瓊脂培養基，分別使得培養基中所含有的大蒜廢水終濃度為0.5%~4%，充分混勻，倒平板。待凝固后，用移液器吸取100μL制備好的菌懸液均勻涂布于平板中，放入37℃恒溫培養箱中培養24h，每個菌每個濃度重復3次[13-14]，以培養基:去離子水=9:1(v/v)的LB培養基為空白對照（陰性對照），以含50μg/mL卡那霉素的LB培養基為陽性對照。

1.2.5大蒜廢水對耐藥菌株的抑菌活性的測定根據上述普通菌株的最小抑菌濃度的方法配制含大蒜廢水的營養瓊脂培養基，分別用移液器吸取制備好的耐藥菌株ATCC43300，ATCC6538，CMCC(B)2600，ATCC35764菌懸液各100μL均勻涂布于平板中，放入37℃恒溫培養箱中培養24h，每個菌株重復3次，空白對照為培養基:去離子水=9:1(v/v)的LB培養基。

1.2.6溫度對大蒜廢水抑菌效果的影響該將大蒜廢水分成四份，分別置于4、37、70、90℃水浴中處理1h，然后按最小抑菌濃度測定方法配成含大蒜廢水的營養瓊脂培養基，涂布100μL金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌，觀察經過不同溫度處理后的大蒜廢水能否抑制普通微生物的生長。

1.2.7放置時間對大蒜廢水抑菌效果的影響將大蒜廢水原液在室溫下放置1、3、5、7d后取出與培養基混合成含大蒜廢水的營養瓊脂培養基，涂布100μL金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌，觀察放置不同天數后的大蒜廢水能否保持抑菌活性。

1.3數據統計分析

1.3.1大蒜廢水中大蒜辣素含量的測定取5mL10mmol/L半胱氨酸溶液，加1mL去離子水，搖勻后取1mL于100mL的容量瓶中，定容至刻度，取定容后的半胱氨酸溶液4.5mL與0.5mL的DTNB溶液，25℃保溫15min，然后412nm波長測定半胱氨酸吸光值A0，按同樣操作將去離子水替換為大蒜廢水原液，測定半胱氨酸吸光值A。1.3.2溫度對大蒜廢水中大蒜辣素含量的影響取2mL大蒜廢水原液4組，分別在4、37、70、90℃條件下處理60min，每處理10min后取出，按上述

1.3.2中大蒜辣素含量的測定方法，以各溫度下，大蒜辣素含量為縱坐標，處理時間為橫坐標，作大蒜辣素含量——溫度關系圖。

1.3.3大蒜廢水放置時間對大蒜辣素含量的影響將大蒜廢水原液在室溫下分別放置1、2、3、4、5、6、7d后測定大蒜廢水中大蒜辣素的含量，大蒜辣素含量為縱坐標，放置時間為橫坐標，作大蒜辣素含量——放置時間關系圖。

2結果與分析

2.1大蒜廢水對普通菌株的最小抑菌濃度

當LB培養基中大蒜廢水的含量為0.5%~1.2%及空白組條件下，大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌均能夠正常生長，在高濃度大蒜廢水以及卡那霉素的陽性條件下，微生物生長被抑制，說明一定濃度的大蒜廢水能夠產生類似卡那霉素的抑菌效果（圖1和圖2），其中大蒜廢水在3.0%的濃度下，明顯抑制了大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長（圖2a和圖2c），而大蒜廢水對枯草芽孢桿菌的作用更加明顯，在濃度為2.5%時，能夠抑制枯草芽孢桿菌的生長（圖2b）。這說明大蒜廢水對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑制濃度為3.0%（V/V），而對枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度為2.5%，通過大蒜廢水中大蒜辣素含量為529μg/mL可知(表1)，大蒜廢水中大蒜辣素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑制濃度為15.87μg/mL，而對枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度為13.23μg/mL。在已有的文獻報道中，大蒜辣素對革蘭氏陰性菌的最小抑菌濃度為15~30μg/mL，而對革蘭氏陽性菌的最小抑菌濃度為5~10μg/mL[7]，這與本研究中的實驗結果接近，進一步表明，大蒜廢水具有明顯的抑菌效果正是由于含有大蒜辣素。

2.2大蒜廢水對耐藥菌株的抑菌活性

空白組（以去離子水代替大蒜廢水與瓊脂配制成的培養基）中的耐藥菌株均能正常生長，而當培養基中含有3%（V/V）濃度的大蒜廢水時，培養皿無可見菌落，表明對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度對耐藥菌株同樣具有抑菌活性，即大蒜廢水含有15.87μg/mL的大蒜辣素時，能夠抑制耐藥菌株的生長，在其對普通微生物菌株的最小抑菌濃度條件下對耐藥菌株同樣具有抑菌活性，在已有的數據表明，大部分菌株對大蒜辣素敏感，最小抑菌濃度為16μg/mL，另外，當大蒜辣素作用于耐藥（甲氧西林）與非耐藥的表皮葡萄菌時，兩種菌株的生長均受到抑制[7]，這說明大蒜廢水中15.87μg/mL的大蒜辣素足以表現出對耐藥菌株的抑菌活性。

2.3溫度和放置時間對大蒜廢水抑菌活性的影響

2.3.1溫度對大蒜廢水抑菌活性的影響

在90℃水浴處理的大蒜廢水培養皿中出現了菌落的生長，說明大蒜廢水經90℃處理后，失去活性；而經過4、37、70℃水浴處理后的大蒜廢水培養皿中沒有出現菌落，說明大蒜廢水在4、37、70℃處理后沒有完全喪失其抑菌活性，即大蒜廢水可以在4~70℃溫度下保持穩定[14]，同時，通過測定上述溫度處理不同時間后，大蒜廢水中大蒜辣素的含量，結果如圖5所示，在90℃處理下，大蒜廢水原液中大蒜辣素的含量下降較快，處理60min后，大蒜辣素的含量只有400μg/mL，在3%大蒜廢水的培養基不足以抑制微生物的生長，而在4~70℃溫度條件下，大蒜辣素的含量下降緩慢，大蒜辣素含量仍然足以抑制微生物生長，從圖5可以發現，溫度越高，大蒜廢水中大蒜辣素破壞的速率越快[15]。大蒜廢水中大蒜辣素在4~70℃具有良好的熱穩定性，這一特性為今后大蒜廢水開發成抗生素替代品提供了更多的可能性。

2.3.2大蒜廢水室溫放置不同時間后抑菌活性的變化

在室溫條件下放置1、3、5d后的大蒜廢水仍然能夠保持良好的抑菌活性，而放置7d后，抑菌活性下降，培養皿中出現了普通菌株的生長，說明在室溫條件下，大蒜廢水能夠持續較長時間抑制普通菌株的生長，通過測定放置不同時間后大蒜廢水原液中大蒜辣素的含量發現，放置5d后，大蒜廢水中的大蒜辣素含量仍保持在80%以上，這與已有的研究結果相吻合[16]，同時隨著放置時間的增加，大蒜辣素的下降越來越快，放置6d后，大蒜辣素含量不足以抑制微生物生長。在已有的研究結果中，大蒜辣素避光保存后至35d后仍能夠保持抑菌活性[14]，相比已有文獻，本實驗中大蒜廢水中大蒜辣素存放時間大大縮短，可能是由于水溶液中大蒜辣素不夠穩定[15]，在后期的開發中，可以選擇合適的有機溶劑以低溫條件下保存大蒜辣素[17-18]。

3結論

綜上所述，大蒜廢水由于含有大蒜辣素而具有良好的抑菌活性，能夠同時抑制大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的生長，并且確定3%為大蒜廢水的最小抑菌濃度（對枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度為2.5%），進一步發現3%濃度的大蒜廢水能夠明顯地抑制耐藥菌株的生長。通過對大蒜廢水高溫處理、室溫放置不同時間等一系列實驗，說明該大蒜廢水在70℃溫度處理下具有較好的熱穩定，同時其能夠在水溶液、室溫條件下存放5~6d而保持明顯抑菌活性。

4展望

大蒜廢水中具有大蒜辣素而表現出明顯的抑菌活性，并且在較低的濃度時，便能抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的生長，顯現出大蒜廢水替代抗生素的巨大潛力，同時對耐藥菌株的作用為大蒜廢水將來的臨床研究奠定基礎，大蒜廢水的合理利用，可以有效地解決大蒜廢水環境污染這一亟待解決的問題。

作者：季瑩瑩1;肖勇2;湯魯宏1 單位：1.江南大學藥學院，2.無錫疾病預防控制中心