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《農產品加工雜志》2015年第六期

1材料與方法

安琪高活性酵母，安琪酵母股份有限公司產品；蝸牛酶，國藥集團化學試劑有限公司產品；溶壁酶，國藥集團化學試劑有限公司產品；β-葡聚糖酶，國藥集團化學試劑有限公司產品；中性甲醛、NaCl和NaOH等，均為分析純。NS2006型高壓均質機，北京天恩瀚拓科技有限公司產品；JY98-ⅢDN型超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司產品；752PC型紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司產品；SSW-600-2S型電熱恒溫水槽，上海博迅實業有限公司醫療設備廠產品；5804R型離心機，北京博儀恒業科技發展有限公司產品。氨基態氮的測定采用甲醛滴定法[18]，參照中華人民共和國國家標準GB/T23530—2009（酵母抽提物）。配制適宜質量分數的酵母溶液，考察不同破壁方法在各自最適條件下對酵母破壁的影響[19]。酶法破壁是通過預試驗篩選出蝸牛酶、溶壁酶、β-葡聚糖酶3種效果較好的酶后，再通過單因素試驗探索3種酶在不同破壁時間、破壁溫度和破壁pH值條件下的破壁效果，選出破壁效果更好的酶；高壓均質法考察均質壓力、均質循環次數以及酵母質量分數3個因素對破壁效果的影響；超聲波法破壁超聲功率、超聲時間和酵母質量分數3個因素對破壁結果的影響；自溶法考察自溶時間、自溶溫度、自溶pH值以及自溶促進劑對破壁結果的影響。最后對4種不同破壁方法的結果進行比較分析，篩選出破壁效果最好的一種，并利用正交試驗進行優化設計，以期得出該方法下的最佳工藝條件。

2結果與討論

2.1超聲波破壁

2.1.1超聲功率對酵母破壁的影響在酵母質量分數為5%，超聲時間30min的條件下探究60，70，80，90，100W超聲功率下的氨基氮得率，從而確定最佳超聲功率。由圖1可知，隨著超聲功率的不斷增加，氨基態氮得率也隨之不斷增加。因為超聲波是通過縱波不斷對細胞進行沖擊來達到對細胞壁的破碎效果。因此，功率越高對細胞的破碎效果也就越好，故超聲功率在100W時為最佳，此時氨基氮含量可達0.060g/100mL，約占酵母干質量的1.10%。

2.1.2超聲時間對酵母破壁的影響酵母質量分數5%，超聲功率100W的條件下，通過檢測氨基氮得率來確定最佳超聲時間。超聲時間對酵母破壁的影響見圖2。由圖2可知，隨著超聲時間的增加，氨基氮得率呈現不斷上升趨勢，在超聲時間25~30min，氨基氮的得率變化隨著時間增加而變大；在超聲時間35~40min，氨基氮的得率變化趨于平緩。因為超聲時間達到一定程度后，在該條件下的酵母破壁效果已經達到了最佳，再延長超聲時間也對破壁效果沒有明顯促進作用，故超聲時間可確定為35min。在該條件下的氨基氮含量可達0.063g/100mL，約占酵母干質量的1.15%。

2.1.3酵母質量分數對酵母破壁的影響在超聲功率100W，超聲時間35min的條件下，探索超聲破壁的最佳酵母質量分數。酵母質量分數對酵母破壁的影響見圖3。由圖3可知，隨著酵母質量分數的增加，氨基氮得率也不斷增加，但在酵母質量分數達到5%后，增加趨勢明顯緩慢，可能是由于酵母質量分數過高，達到超聲波所能處理的最大酵母細胞數量。因此，選擇5%的酵母質量分數進行超聲波破壁最為合適，氨基氮含量可達0.064g/100mL，約占酵母干質量的1.16%。

2.2酶法破壁

酶法破壁是目前較為廣泛采用的破碎細胞壁方法之一，而且破壁效果相對來說也較理想。因此，本節將探索不同來源的酶對酵母破壁效果的影響。選取破壁中3種比較常見的破壁酶進行試驗，分別為溶壁酶、蝸牛酶和β-葡聚糖酶。在各自的最適溫度、pH值條件下，進行酶解破壁。以氨基氮得率為指標，結果表明蝸牛酶的破壁效果最好。因此，選擇蝸牛酶進行單因素試驗。

2.2.1蝸牛酶破壁時間對酵母破壁的影響在蝸牛酶破壁溫度、蝸牛酶添加量等條件固定的情況下，探索蝸牛酶破壁時間對酵母破壁的影響。蝸牛酶破壁時間對酵母破壁的影響見圖4。隨著破壁時間推移，氨基氮的得率呈上升趨勢，但超過7h后，上升趨勢趨于緩和，再延長破壁時間對破壁效果影響不大，反而降低了效率。因此，破壁時間在7h為宜，此時氨基氮含量可達0.104g/100mL，約占酵母干質量2.04%。

2.2.2蝸牛酶破壁溫度對酵母破壁的影響向酵母液中加入10mg/mL的蝸牛酶，調節pH值為5.0，蝸牛酶破壁7h，探索在40，45，50，55，60℃的不同溫度條件下蝸牛酶的破壁效果。蝸牛酶破壁溫度對酵母破壁的影響見圖5。由圖5可知，在40~55℃下，隨著蝸牛酶破壁溫度的升高，氨基氮得率也隨之增加，但超過55℃后氨基氮得率呈現下降趨勢。可能是由于超過蝸牛酶的最適反應溫度后，蝸牛酶的活性減弱，導致破壁效率也減弱。因此，蝸牛酶破壁溫度選取55℃為宜，此條件下氨基氮含量最高可達0.089g/100mL，約占酵母干質量1.74%。

2.2.3蝸牛酶添加量對酵母破壁效果的影響在蝸牛酶破壁溫度55℃，破壁pH值5.0的條件下蝸牛酶破壁7h，得到不同添加量條件下的蝸牛酶對酵母破壁效果的影響。蝸牛酶添加量對酵母破壁效果的影響見圖6。由圖6可知，蝸牛酶添加量在6~10mg/mL時，氨基氮得率隨著蝸牛酶添加量的增加而顯著增加；但到超過10mg/mL后氨基氮得率增加不明顯，達到14mg/mL時，已趨于平緩。綜合效益考慮，10mg/mL的蝸牛酶添加量較為合適。結合上述試驗可以得出，在蝸牛酶破壁溫度55℃，破壁pH值5.0，破壁時間7h，蝸牛酶添加量10mg/mL時破壁效果相對較好，游離氨基氮含量最高可達到0.091g/100mL，約占酵母干質量1.74%。

2.3高壓均質破壁法破壁

在機械破壁法中，高壓均質法相對來說破壁效果比較好，通過預試驗發現，單次破壁效果一般，需多次循環破壁才能達到較好效果。

2.3.1酵母質量分數對高壓均質破壁的影響在均質壓力90MPa，均質循環次數3次的條件下，配制酵母質量分數1%，2%，3%，4%，5%進行高壓均質破壁。酵母質量分數對酵母破壁的影響見圖7。由圖7可知，隨著酵母質量分數增加，氨基氮得率也呈上升趨勢，到4%后增加趨勢變緩，4%~5%得率增加不明顯，5%質量分數下氨基氮含量最高為0.063g/100mL。

2.3.2均質壓力對酵母破壁效果的影響配制酵母質量分數5%，在50，60，70，80，90MPa的條件下分別循環3次得到的氨基氮含量。均質壓力對酵母破壁的影響見圖8。由圖8可知，隨著均質壓力增加，氨基氮得率呈不斷上升趨勢，但由于設備條件工作壓力最高為90MPa左右。因此，考慮設備的條件下選擇90MPa的均質壓力，在該條件下氨基氮含量可達0.075g/100mL，占酵母干質量約1.34%。

2.3.3均質循環次數對酵母破壁效果的影響配制酵母質量分數5%，調整均質壓力90MPa，在該條件下分別循環1~5次。由圖9可知，隨著均質循環次數的增加，氨基氮得率也隨著增加，循環4次后，增加趨勢變緩。為簡化工藝，均質循環次數4次為宜。該條件下氨基氮含量可達0.067g/100mL，占酵母干質量1.20%。

2.4自溶法破壁

酵母自溶是酵母在特定的溫度和pH值等條件下，觸發了細胞能消化自身結構的自溶酶分解作用所產生的一種自我分解現象。正常情況下，健壯的酵母胞內酶不會外泄，在不利的環境（如溫度較高、營養缺乏等）下，酵母活力下降、衰老以至死亡，酵母細胞自身的各種水解酶類（如蛋白水解酶、核糖核酸酶、腺苷酸激酶等）作用于各自相應的特定底物，從而發生細胞的自我分解作用。相對于其他破壁方法，自溶法破壁雖然時間消耗比較久，但破壁效果更好，氨基氮得率高，且沒有復雜的后續處理工序。

2.4.1自溶時間對自溶法破壁的影響配制一定質量分數的酵母溶液，在自溶pH值和自溶溫度一定的情況下，加入3%的NaCl，分別自溶22，24，26，28，30h，得到的氨基氮含量。由圖10可知，在22~26h時氨基氮得率顯著增加，超過26h后在26~28h時增加很緩慢，28h以后氨基氮得率呈現下降趨勢。可能是由于自溶趨向完全后，隨著自溶時間推移，氨基酸被進一步分解，分解的速度超過溶出的速度。因此，綜合考慮自溶時間26h為宜，在此條件下得到的氨基氮含量最高可達0.125g/100mL，約占酵母干質量的2.25%。

2.4.2自溶pH值對自溶法破壁的影響影響酵母自溶的因素很多，自溶pH值在這些因素中作用又更加明顯。為此，在一定自溶溫度、自溶時間和NaCl的條件下，探索自溶的適宜pH值。氨基氮得率隨著自溶pH值增加呈現先增加后降低的趨勢，在自溶pH值為5.0時達到最高值，自溶pH值超過5.0后氨基氮得率呈現顯著下降趨勢。因此，自溶pH值在5.0時比較合適，在此自溶pH值條件下氨基氮含量可達0.122g/100mL，占酵母干質量2.18%。

2.4.3自溶溫度對自溶法破壁的影響自溶溫度作為一個重要的因素，在自溶中有著不可忽視的作用。在自溶pH值5.0，自溶時間26h的條件下，配制5%的酵母溶液，分別在不同溫度下自溶。自溶溫度對酵母破壁的影響見圖12。由圖12可知，從40℃開始，氨基氮溶出率隨著自溶溫度升高而不斷增加，在50℃時達到最大值，而且此時酵母抽提液的風味也相對較好。但自溶溫度超過50℃后，氨基氮溶出率迅速下降。可能過高的溫度對酵母本身的水解酶類產生了破壞，導致自溶效果下降，氨基氮溶出率也降低。所以，在50℃時自溶效果最好，在該溫度下氨基氮溶出率可占酵母干質量的2.07%。

2.4.4自溶促進劑對自溶法破壁的影響在酵母自溶的過程中，除了自溶溫度、自溶pH值、自溶時間等這些因素對自溶的結果有很大影響外，自溶促進劑也在這方面起著很大的作用，它通過改變酵母細胞的滲透性，誘導細胞內的自溶酶在特定條件下進行細胞的自我分解，從而加速自溶作用。自溶促進劑不僅能提高自溶的效率，還能增加酵母抽提物的得率和氨基氮的得率。在自溶溫度50℃，自溶時間26h的條件下，調節自溶pH值至5.0，分別加入不同的自溶促進劑促進自溶。自溶促進劑對酵母破壁的影響見圖13。由圖13可知，添加NaCl的效果最好，氨基氮的得率最高；其他幾種自溶促進劑中乙醇效果其次，半胱氨酸效果最差。因此，選擇NaCl作為自溶破壁的促進劑，經過試驗得出3%左右NaCl的效果最好，此時的氨基氮得率最高，達到2.04%，約0.115g/100mL。

2.5自溶法正交試驗

通過對以上幾種破壁方法在各自最佳條件下的破壁效果分析可得，自溶法破壁的效果明顯比其他幾種方法效果更好。在自溶溫度50℃條件下，調自溶pH值5.0，加入3%的NaCl自溶26h得到的氨基氮含量最高可達0.125g/100mL，約占酵母干質量的2.25%。與高壓均質法破壁的氨基氮得率1.34%及超聲波破壁的氨基氮得率1.16%相比較，自溶破壁效果更好，而且比酶法破壁的氨基氮得率2.04%也有明顯的提升。因此，本文采取自溶法為破壁手段，利用正交試驗設計方法對自溶法破壁的幾種條件進行優化，獲取其最佳的工藝條件。

2.5.1正交試驗正交試驗的因素與水平設計見表1。以A，B，C為自變量，氨基氮得率為應變量。正交試驗分析結果與分析見表2。表中K1，K2，K3分別表示氨基氮在各因素水平下的平均提取量（由于有時會遇到各因素水平數不等的情況，因此一般用平均值大小來反映同一個因素的各個不同水平對試驗結果的影響大小。同時，同一因素水平下平均提取量的極差值R（R=Kmax-Kmin）則用來反映各因素水平變化對試驗結果影響的大小。由表中的極差分析結果可以看出RA>RB>RC，說明3個因素中對自溶的影響大小依次為A>B>C。在自溶過程中，自溶時間和自溶溫度對自溶破壁的影響效果要明顯大于自溶pH值，其中自溶時間的影響又最為顯著。因此，在正交試驗范圍內優化得到自溶法破壁的最佳條件為A2，B2，C2，即自溶溫度50℃，自溶pH值5.0，自溶時間26h。

2.5.2驗證試驗按照上述正交試驗得出的優化結果A2，B2，C2，進行3次平行試驗，得到氨基氮的平均含量為0.114g/100mL，約占酵母干質量2.27%，大于正交試驗中的最大值2.13%。因此，利用正交試驗優化自溶法破壁條件是成功的。

2.5.3正交試驗方差分析正交試驗直觀分析法簡便直觀，但不能估算試驗誤差，不能區分試驗結果的差異是由各因素的水平變化還是由隨機波動而導致的。為此，可以對正交試驗結果作方差分析。在設計正交試驗時，作一個空白列。由于空白列中沒有因素作用，所以剛好能夠反映隨機因素引起的誤差。由表3可知，因素A（p<0.05）對試驗結果的影響顯著；因素B（p<0.05）試驗結果的影響顯著；因素C（p>0.10）對試驗結果有一定影響。因此，因素A和B為主要因素，C相對于A，B來說影響較小。對主要因素選擇最佳水平后，次要因素可依據實際選擇適合水平。綜合考慮得到自溶破壁最佳條件為A2，B2，C2，即自溶溫度50℃，自溶pH值5.0，自溶時間26h。

3結論

在對酵母的不同破壁方法進行試驗探索后，可以發現，超聲波法、高壓均質法、酶法和自溶法都有各自的優點與不足。但綜合考慮，自溶法的破壁效率相對較好，與其他方法相比較，更適合工業化生產。通過對自溶法的正交優化試驗得出，自溶法破壁可選擇自溶溫度50℃，自溶pH值5.0，在此條件下再根據實際情況選擇自溶時間。上述試驗得出的自溶時間條件為26h，但由于是相對于其他因素來說對氨基氮的影響沒有那么重要，延長一段時間可能還能讓氨基氮的得率進一步提升。所以，在以后對酵母不同破壁方法研究中還可以嘗試選擇不同時間來進行自溶破壁，同時通過此次試驗初步得到了一個相對較好的自溶法破壁條件，也為以后獲得更優的破壁工藝條件提供了一定線索，從而取得較好的效益。

作者：徐那秦丹蔡水淋劉智禹單位：湖南農業大學食品科學技術學院福建省水產研究所