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《農(nóng)產(chǎn)品加工雜志》2015年第六期

1材料與方法

1.1材料本研究中用于篩選偶氮染料降解菌的環(huán)境樣品取自遼寧某印染廠附近的土壤中。

1.2偶氮降解菌株的篩選（1）稱取采集的環(huán)境土樣1g，放入裝有20mL滅菌蒸餾水的50mL三角瓶中，加入10顆玻璃珠，將三角瓶于震蕩搖床上以轉(zhuǎn)速120r/min振蕩2h，使滅菌水與土樣充分混合，將震蕩后的懸濁液靜置1h，使顆粒物沉淀，上清液即為供接種的環(huán)境樣品。（2）取1mL環(huán)境樣品加入裝有50mLLB液體培養(yǎng)基的100mL三角瓶中，于37℃恒溫振蕩培養(yǎng)12h。采用相同方法接種一代培養(yǎng)菌液1mL至新鮮的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，使樣品中的好氧菌群得到富集和活化。（3）分裝甲基紅篩選培養(yǎng)基50mL于100mL三角瓶中，接種第2次活化菌液1mL進(jìn)行篩選培養(yǎng)。采用此方法對(duì)混合菌液連續(xù)篩選培養(yǎng)，觀察甲基紅的降解效果，初步確定混合菌液中存在能夠高效降解甲基紅的菌株。（4）將篩選后的混合菌群在固體培養(yǎng)基（甲基紅質(zhì)量濃度為100mg/L）上進(jìn)行劃線分離，且對(duì)長出進(jìn)行的單落劃線培養(yǎng)，最終分離出一株能高效降解甲基紅的細(xì)菌。（5）將篩選出的菌株轉(zhuǎn)接種于LB液體培養(yǎng)基，并向其中加入20%的甘油作為保護(hù)劑，于-40℃冰箱中保藏。

1.3降解菌株的鑒定本研究采用16SrDNA序列分析的方法對(duì)分離的好氧偶氮降解菌進(jìn)行鑒定。菌株基因組DNA的提取按本研究組之前所描述的方法進(jìn)行。以提取的基因組DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物27F：5''''-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3''''；1492R：5''''-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3''''對(duì)細(xì)菌的16SrDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)；72℃保溫10min，4℃保存。將經(jīng)純化后的PCR產(chǎn)物連接至pMD18-T質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)中，挑取陽性克隆子進(jìn)行序列測(cè)定。將拼接后的菌體16SrDNA序列提交至GneBank數(shù)據(jù)庫。并根據(jù)測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比對(duì)，下載相關(guān)序列，并對(duì)序列進(jìn)行親緣性及系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.4菌體生長曲線及染料降解曲線測(cè)定（1）將保藏的菌種按接種量2%接種到LB液體培養(yǎng)基中，使菌體活化。（2）將活化后的菌液按接種量2%接種到含有100mg/L甲基紅的液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2h取樣測(cè)菌體于波長600nm處的吸光度（以液體篩選培養(yǎng)基為空白對(duì)照）。（3）取2mL菌液離心后于波長490nm處測(cè)甲基紅的剩余吸光度，以含有100mg/L甲基紅的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，并計(jì)算甲基紅降解率。

1.5不同理化因素對(duì)菌株降解偶氮染料的影響

1.5.1溫度對(duì)菌體生長及染料降解的影響將經(jīng)活化后的菌株H7按2%的接種量接種至降解培養(yǎng)基中（含有100mg/L的甲基紅），分別置于20~55℃的環(huán)境下培養(yǎng)12h后，取3mL菌液測(cè)定其12h后菌株H7的生長量（OD600）及甲基紅降解率。

1.5.2pH值對(duì)菌體生長及染料降解的影響將經(jīng)活化后的菌株H7按2%的接種量接種至降解培養(yǎng)基中（含有100mg/L的甲基紅），培養(yǎng)基的pH值分別為4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0和11.0，于37℃好氧培養(yǎng)12h后，取3mL菌液測(cè)定菌株H7的OD600及甲基紅降解率。

1.6菌株H7對(duì)不同偶氮染料的降解在降解培養(yǎng)基中分別加入具有不同結(jié)構(gòu)的偶氮染料（甲基紅、橙黃Ⅰ、剛果紅、鉻黑T、甲基橙、酸性媒介紅B），使上述染料在培養(yǎng)基中的質(zhì)量濃度均達(dá)到100mg/L。將經(jīng)活化后的菌株H7按2%的接種量接種至含有不同染料的降解培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)，觀察不同染料在培養(yǎng)基中的降解情況。

2結(jié)果與分析

2.1偶氮染料降解菌株的初步篩選本研究采用不斷在培養(yǎng)基中加入偶氮染料的方法對(duì)環(huán)境樣品中可能存在的降解菌株進(jìn)行富集，并得到了可以穩(wěn)定降解偶氮染料的混合菌群。對(duì)混合菌群進(jìn)行劃線分離后，選取一株好氧條件下有效降解甲基紅的菌株進(jìn)行研究，并將該菌株標(biāo)記為H7。菌株H7對(duì)甲基紅的降解結(jié)果見圖1。由圖1可知，將菌株H7劃線于含有100mg/L甲基紅的LB固體培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)后可觀察到平板上長有菌體的區(qū)域已逐步變?yōu)闊o色直至透明，表明菌株H7可以有效地使甲基紅脫色。

2.2降解菌株的分子生物學(xué)鑒定本研究擴(kuò)增了降解菌株的16SrDNA部分序列，以期對(duì)該菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。測(cè)序結(jié)果表明，PCR產(chǎn)物的長度為1504bp。將序列與NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)后，下載相關(guān)序列，共同進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。基于各菌株的16SrDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹見圖2。本研究所篩選出的降解菌株可以與志賀氏菌屬（Shigella）菌株聚為一枝，且與腸桿菌科的菌物親緣關(guān)系很近。基于此，筆者認(rèn)為本研究所分離到的降解菌株屬于志賀氏菌屬，并將該菌株定名為Shigellasp.H7。目前，很少有報(bào)道表明志賀氏菌屬菌物有降解偶氮染料的能力。然而，與其親緣關(guān)系相近的腸桿菌科的其他菌物則被證明具有偶氮染料的降解能力。例如，成團(tuán)腸桿菌（Enterobacteragglomerans）、奇異變形桿菌（Proteusmirabilis）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiellapneumoniae）及大腸埃希氏菌（Es－cherichiacol）i等。其中，肺炎克雷伯氏菌和大腸埃希氏菌已被證明可以分別在厭氧、微好氧及好氧的條件下降解偶氮染料。因此，筆者認(rèn)為腸桿菌科的大部分種屬的菌物可能均具有相似的偶氮染料降解能力，今后可重點(diǎn)對(duì)腸桿菌科菌物降解偶氮染料的能力進(jìn)行研究，以明確它們降解染料的機(jī)理。另外，腸桿菌科的部分菌株為兼性好氧菌，其在不同氧分條件下均能降解偶氮染料的能力，為其今后的工業(yè)化應(yīng)用提供了有利的條件。

2.3菌株的生長曲線及偶氮染料的降解曲線在本研究中，將菌株H7接入含有質(zhì)量濃度100mg/L甲基紅的LB培養(yǎng)基中，每隔2h分別測(cè)定染料的降解率和菌體的生長曲線。菌株H7的生長曲線及偶氮染料的降解曲線見圖3。由圖3可知，菌株的生長及甲基紅的降解是基本同步的。在度過前2h的適應(yīng)期后，菌株H7在染料培養(yǎng)基中快速生長；12h后菌體的OD600值達(dá)到約為1.3，可見100mg/L的甲基紅對(duì)菌株的生長無抑制作用。在整個(gè)生長過程中，菌株H7可快速降解甲基紅，結(jié)果表明10h內(nèi)菌株對(duì)甲基紅的降解率達(dá)到90%以上。以上結(jié)果表明，菌株H7是一株在好氧條件下對(duì)甲基紅脫色能力很強(qiáng)的細(xì)菌。

2.4溫度對(duì)菌體生長及偶氮染料降解的影響本研究中測(cè)定了在20~55℃內(nèi)，菌株H7在培養(yǎng)基中的生長情況與對(duì)甲基紅的脫色情況。溫度對(duì)菌株H7生長及偶氮染料降解的影響見圖4。由圖4可知，菌株H7對(duì)甲基紅的最適脫色溫度為40℃，在此溫度下約有95%的染料在12h內(nèi)被降解，且在染料的脫色過程中菌株能夠很好地生長。當(dāng)溫度為25~50℃時(shí)，菌株H7對(duì)甲基紅均能進(jìn)行較為有效的脫色，如在50℃時(shí)菌株H7經(jīng)12h培養(yǎng)后可降解約60%的甲基紅。然而，當(dāng)溫度低于25℃或高于50℃時(shí)，甲基紅的降解速率急劇下降，偶氮染料脫色并不明顯。在研究中，溫度對(duì)偶氮染料的降解影響較為明顯。這與之前的研究成果是相一致的。如WongPK等人[15]報(bào)道的肺炎克雷伯氏菌株RS-13在溫度過高（大于45℃）時(shí)即失去了降解偶氮染料的能力。相似的結(jié)論在研究大腸桿菌及淺黃色假單胞菌（Pseu－domonasluteola）對(duì)偶氮染料的脫色時(shí)均有報(bào)道[13，17]。高溫主要抑止菌株的正常生長及細(xì)胞內(nèi)偶氮還原酶的活性，從而造成染料脫色效率的下降。

2.5pH值對(duì)菌體生長及偶氮染料降解的影響研究測(cè)定了當(dāng)降解體系的pH值在4~11時(shí)，菌株H7的生長情況與對(duì)甲基紅的脫色情況。pH值對(duì)菌株H7生長和偶氮染料降解的影響見圖5。當(dāng)降解體系的pH值維持在5~10，pH值的變化并未對(duì)偶氮染料的脫色造成明顯影響，在上述pH值的條件下，經(jīng)過12h的培養(yǎng)，菌株H7均可維持對(duì)甲基紅約80%以上的脫色率。菌株H7對(duì)甲基紅降解的最適pH值為7，在此條件下大于98%的甲基紅于12h內(nèi)被降解。當(dāng)pH值為4時(shí)，菌株H7生長量與染料的脫色率均出現(xiàn)了明顯下降，只有不到50%的甲基紅在規(guī)定時(shí)間被降解。然而，菌株H7卻可以在堿性條件下對(duì)甲基紅進(jìn)行降解，在pH值達(dá)到11時(shí)，菌株H7可在12h內(nèi)降解約60%的甲基紅。無論在好氧條件還是在厭氧條件下，細(xì)菌對(duì)偶氮染料降解的最佳條件一般均為近中性。降解體系的pH值過高或過低均對(duì)偶氮染料的脫色有負(fù)面影響[18-19]。

2.6菌株H7對(duì)不同偶氮染料的脫色研究測(cè)定了菌株H7在好氧條件下對(duì)具有不同化學(xué)結(jié)構(gòu)偶氮染料的脫色效果。在脫色培養(yǎng)基中分別加入100mg/L的橙黃Ⅰ、剛果紅、鉻黑T、酸性媒介紅B，以及甲基紅、甲基橙后，接種菌株H7后置于震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。菌株H7對(duì)不同染料的降解能力見圖6。由圖6可知，菌株H7對(duì)各種染料的降解時(shí)間和降解率均有所不同。菌株H7可在16h內(nèi)降解幾乎全部的橙黃Ⅰ和甲基紅；對(duì)酸性媒介紅B和剛果紅的降解率也分別達(dá)到了90%和80%。表明菌株H7對(duì)上述4種染料均具有良好的脫色能力。菌株H7對(duì)鉻黑T也具有一定的脫色能力，16h后約有60%的鉻黑T被最終脫色。然而，甲基橙不易被菌株H7所降解，經(jīng)16h的反應(yīng)后只有約25%的甲基橙被最終降解。菌株對(duì)不同偶氮染料降解的能力和效率的差異性除了取決于菌株的自身特性外，還主要取決于染料自身的化學(xué)結(jié)構(gòu)。一般情況下，化學(xué)結(jié)構(gòu)較簡單的偶氮化合物比較容易降解，如研究中所應(yīng)用的甲基紅和橙黃Ⅰ。另外，偶氮化合物中含有各種取代基，尤其是磺酸基不利于菌株的生物降解[16]。在研究中，菌株H7對(duì)鉻黑T的降解能力不高，可能是因?yàn)槠浠瘜W(xué)結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)磺酸基的原因。

3結(jié)論

本研究在環(huán)境樣品中分離到一株可以在好氧條件下對(duì)偶氮染料進(jìn)行降解的菌株H7。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定后，發(fā)現(xiàn)該菌株屬于志賀氏菌屬的菌株；該菌株可在好氧條件下高效降解甲基紅。理化因素對(duì)菌株H7的影響顯示，該菌株H7可在溫度為25~50℃，pH值為5~10及鹽度為1%~3%的條件下對(duì)甲基紅進(jìn)行有效降解；另外，菌株H7可對(duì)多種具有不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的偶氮染料進(jìn)行降解。以上的特性為其將來應(yīng)用于染料廢水的工業(yè)化脫色創(chuàng)造了良好的條件。

作者：李威崔岱宗林璐瑤邸新李少龍趙敏單位：東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院