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《食用菌學報》2016年第1期

摘要：

考察添加不同濃度的氧化鋁（粒徑為200～300目）對灰樹花發(fā)酵菌絲體生長及多糖（胞內和胞外粗多糖）產量的影響。結果表明，在試驗添加范圍內，灰樹花菌球直徑隨氧化鋁添加濃度的增加而顯著變小，當添加氧化鋁濃度為20g／L時，游離菌絲體明顯增多，且菌球主要表現(xiàn)為S型（D＜0．5cm，D：菌體當量直徑，與對象具有相等面積的圓形的直徑），其中L（D≥1．5cm）、M（0．5cm≤D＜1．5cm）和S型菌絲體的比例分別為4．9％、24．3％和70．8％；添加3g／L氧化鋁時灰樹花菌絲體生物量最高，達到5．81g／L，比空白組提高了2．7倍；添加20g／L氧化鋁時灰樹花胞外多糖產量達到最大，為8．46g／L，為空白組的1．7倍左右，而菌絲體多糖產量以添加0．1g／L氧化鋁時最高，為65．6mg／g。

關鍵詞：

灰樹花；氧化鋁；菌絲體形態(tài)；胞外多糖

灰樹花又名貝葉多孔菌，栗子蘑等，日本俗稱“舞茸”［1］，具有免疫調節(jié)、抗腫瘤、抗HIV、降血糖等功效［2－3］。液體發(fā)酵技術具有培養(yǎng)周期短、產品質量穩(wěn)定、生產胞外活性產物等優(yōu)勢，因此，灰樹花發(fā)酵過程優(yōu)化和調控也獲得了國內外學者廣泛關注［4－5］。絲狀真菌是多細胞結構，主要以頂端延長方式進行生長。在絲狀真菌的液體發(fā)酵過程中，菌體形態(tài)是一項重要的工藝參數(shù)，與發(fā)酵醪的流變特性、傳質特性、目的產物的積累密切相關［6］，因此，研究真菌菌體形態(tài)及其調控策略是當前熱點之一［7］。通常，深層發(fā)酵過程中，真菌多以球狀菌絲體、團簇狀菌絲體和游離菌絲體等3種形態(tài)存在。其中，球狀菌絲體為球形的較為穩(wěn)定、規(guī)則的菌絲聚集體，而團簇狀菌絲體的聚集機制與類型則具有非規(guī)則性和隨機性，絲狀真菌的菌體形態(tài)由環(huán)境和基因組共同決定［8］。研究表明，小粒徑的顆粒物質（微粒子）可通過阻礙菌絲聚集等作用改變菌體形態(tài)［9］，故添加微粒子控制絲狀真菌菌體形態(tài)和增強其發(fā)酵產物的產量也成為近期研究熱點之一［10］。比如DRIOUCH等發(fā)現(xiàn)，添加25g／L粒徑為8μm的金屬鈦氧化物TiSiO4，黑曲霉的菌球直徑由1．7mm減小到了0．3mm，且所產的呋喃果糖苷酶和葡萄糖淀粉酶活力分別提高了3．7倍和9．5倍［11］。由于氧化鋁粒徑小、硬度高、難溶于水，并且無毒無臭，也已應用于改善多種絲狀真菌菌體形態(tài)和發(fā)酵性能。例如，KAUP等通過添加一定粒徑的Al2O3來調控海洋真菌的形態(tài)和過氧化物酶的產量［9］。筆者在前期研究的基礎上，使用添加不同濃度Al2O3培養(yǎng)基發(fā)酵灰樹花，考察菌絲體形態(tài)、菌絲體生物量及胞內和胞外粗多糖產量，以期了解微粒子對食藥用真菌深層發(fā)酵過程中菌絲體生長和產物合成的影響。

1材料與方法

1．1供試菌株與培養(yǎng)基

灰樹花菌株CS－15由江蘇大學生物工程實驗室保存。菌種培養(yǎng)基（g／L）：20葡萄糖，5蛋白胨，1．5磷酸二氫鉀，0．75七水硫酸鎂。發(fā)酵培養(yǎng)基（g／L）：30葡萄糖，6蛋白胨，3磷酸二氫鉀，1．5七水硫酸鎂。

1．2試劑與儀器設備

Al2O3（200～300目）購自阿拉丁試劑有限公司，使用10mL醋酸鈉緩沖液（50mmol／L，pH6．5）配制成300g／L的Al2O3懸浮液。葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、醋酸鈉等試劑均為分析純。體視顯微鏡為奧林巴斯株式會社產品，真空冷凍干燥機為北京博醫(yī)康儀器設備有限公司產品。

1．3液體發(fā)酵

灰樹花試管種經PDA平板活化（28℃培養(yǎng)5d），取10塊5mm×5mm的菌塊接種于裝有100mL液體菌種培養(yǎng)基的250mL三角瓶內，28℃、150r／min培養(yǎng)3d，制得種子液。發(fā)酵培養(yǎng)基添加Al2O3懸浮液至Al2O3終濃度0．1、0．5、1、3、6、10、15和20g／L，500mL三角瓶裝供試培養(yǎng)基140mL，接種10％液體種子液，28℃、150r／min條件下培養(yǎng)3d。發(fā)酵結束后，取樣分析灰樹花菌絲體形態(tài)分布，測定菌絲體生物量、胞外多糖和菌絲體多糖產量。每個處理設3個重復。

1．4菌絲體形態(tài)的觀察

收集灰樹花發(fā)酵菌絲體，蒸餾水洗滌后置于平板中，采用數(shù)碼相機及體視顯微鏡拍照取像。根據菌絲體當量直徑（與對象具有相等面積的圓形的直徑）大小將菌絲體形態(tài)分為L（D≥1．5cm）、M（0．5cm≤D＜1．5cm）和S（D＜0．5cm）型。

1．5菌絲體生物量的測定

取發(fā)酵醪，8000g離心20min，上清液備用；將收集的菌絲體過300目尼龍篩，用蒸餾水反復洗滌菌絲體去除氧化鋁［12］，菌絲體冷凍干燥，稱重。

1．6粗多糖的提取

胞外粗多糖提取：取1．5中離心后的上清液，旋轉蒸發(fā)濃縮至原體積的1／5左右，加入4倍體積的無水乙醇，4℃靜置過夜，10000g離心10min，沉淀冷凍干燥至恒重，既得胞外粗多糖。菌絲體粗多糖提取：取凍干后的菌絲體，勻漿機打碎，90℃熱水（料液比1∶25，w／v）提取2h［13］，10000g離心20min，將提取液旋轉蒸發(fā)濃縮至原體積的1／3左右，加入4倍體積無水乙醇，沉淀、離心和凍干同胞外粗多糖制備，得菌絲體粗多糖。

1．7數(shù)據處理

實驗數(shù)據采用SPSS10．0軟件進行處理。圖和表中結果為3個重復的平均值±標準偏差。采用one－wayANOVA進行試驗數(shù)據的方差分析，P＜0．05表示差異顯著。2結果與分析2．1Al2O3添加量對灰樹花菌絲體形態(tài)分布的影響Al2O3添加濃度對灰樹花菌絲體形態(tài)變化和大小分布的影響如圖1和圖2所示。空白對照組中菌球直徑較大，主要在0．8～2．0cm之間，且菌球四周有刺狀絨毛，此時L型與M型菌絲體的含量相當，分別為45．4％和49．8％。Al2O3添加量為0．1g／L和0．5g／L時，直徑0．6～1．0cm的菌球開始增多且絨毛明顯，菌絲體松散，呈放射狀。隨著Al2O3濃度的增加，菌球直徑逐漸變小，M型與S型菌絲體的比例增加，而L型菌絲體的含量卻相應減少。Al2O3濃度為1．0g／L時，M型菌絲體比例達到最高，為58．7％，略高于0．5g／L中的57．2％。6．0g／L時出現(xiàn)了扁長狀的游離菌絲體，菌球也更為緊實。當Al2O3添加濃度為20．0g／L時，菌絲體主要表現(xiàn)為較小的菌球和游離菌絲體，其中菌球中L型菌絲體所占比例僅為4．9％，且菌絲體表面吸附了大量的Al2O3，而S型菌絲體比例高達70．8％。

2．2Al2O3添加量對菌絲體生物量及多糖產量的影響

不同Al2O3添加量對灰樹花菌絲體生物量、胞內外多糖產量的影響見圖3。空白對照組中菌絲體生物量最低，為2．13g／L，隨著Al2O3添加濃度的增加，菌絲體生物量也增加，并在3g／L時達到最大值5．81g／L，約為空白對照的2．7倍。然而高濃度的Al2O3對生物量并沒有持續(xù)增加的作用，反而導致了生物量的降低，Al2O320g／L時菌絲體生物量為2．35g／L，略高于對照組。由此可見，適宜濃度的Al2O3對灰樹花的菌絲體生長具有明顯的促進作用，但是較高的濃度則產生抑制效應。Al2O3添加量為20．0g／L時灰樹花胞外多糖產量最高，為8．46g／L；其他添加濃度下，胞外多糖產量與空白對照差異不顯著。在Al2O3添加量為0．1g／L和3．0g／L時，灰樹花菌絲體多糖產量顯著高于其他添加濃度處理組及空白對照組，其中添加量為0．1g／L時，菌絲體多糖產量最高。

3討論

添加微粒子作為一種新型的絲狀真菌形態(tài)控制策略，已引起了國內外相關研究者的關注。筆者在灰樹花發(fā)酵過程中添加同一粒徑的不同濃度氧化鋁后，灰樹花菌絲體形態(tài)呈明顯的多樣化。較高濃度的氧化鋁（10～20g／L）促使菌球直徑減小，并且生成較多的游離菌絲體甚至短小的菌絲片段。已有的研究結果表明，液體培養(yǎng)時，微粒子與菌絲之間發(fā)生碰撞，且加劇了攪拌對菌絲體的剪切作用，阻止或阻礙了菌絲聚集及菌球形成［14］。該結果與高速機械攪拌的效果相似，均能有效控制或者降低菌球的大小。添加微粒子除了在一定程度上調控絲狀真菌的菌體形態(tài)，也顯著影響目的產物的產量。當添加15．0g／L粒徑為42μm的Al2O3時，真菌C．fumago的氯過氧化物酶產率顯著提高，為空白組的5倍，且酶活達到了1000U／mL［9］；GAO等在深黃被孢霉（Mortierellaisabellina）培養(yǎng)中分別添加0．1～10．0g／L的硅酸鎂，隨著微粒子濃度的增加，菌體逐漸變小，在10．0g／L時脂肪含量和產率達到最大值，每克菌體干重含脂肪0．75g，每消耗1g葡萄糖產脂肪0．18g，脂肪產量是空白組的2．5倍，此時菌體形態(tài)主要為游離菌絲體［15］。在本研究中，適宜濃度的氧化鋁對灰樹花的菌絲體生長、胞內外多糖的合成也具有一定的促進作用，氧化鋁高添加量（20．0g／L）下，游離菌絲體增多，菌絲球主要呈S型，雖生物量較低，但胞外多糖的產量卻達到最高值，相比空白組提高了1．7倍，這也表明體積較小的菌絲體其內部的溶氧、傳質較為順利，因而有利于胞外多糖的積累，團塊狀的大型菌絲體極大限制了氧氣、營養(yǎng)物質的傳輸。因此，添加微粒子為精確調控食藥用真菌菌絲體的生長和形態(tài)以及產物合成提供了新的思路。

參考文獻

［8］熊強，徐晴，顧帥，等．絲狀真菌形態(tài)控制及其在發(fā)酵過程優(yōu)化中的應用［J］．生物工程學報，2012，28（2）：178－190．

［12］王紅，張?zhí)m天．食品中鋁含量檢測方法的研究［J］．食品工業(yè)，2012，33（11）：191－194．

［13］茆廣華，徐財泉，周曉芬，等．灰樹花粗多糖提取和重金屬去除工藝［J］．食用菌學報，2010，17（1）：76－79．

作者：陳瀟筱 楊焱 崔鳳杰 孫文敬 劉偉民 單位：江蘇大學食品與生物工程學院 上海市農業(yè)科學院食用菌研究所 農業(yè)部南方食用菌資源利用重點實驗室 國家食用菌工程技術研究中心 國家食用菌加工技術研發(fā)中心