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《中國畜牧雜志》2014年第十期

1材料與方法

1.1實驗材料DNAMarker、BL21（DE3）感受態細胞購自TIANGEN、限制性內切酶BamHⅠ和HindⅢ、T4DNAligase購自TaKaRa，IPTG購自Solarbio，標準蛋白分子Marker購自Fermentas，溶菌酶、透析袋購自上海生工，尿素購自BioBasicInc.，咪唑購自Sigma-Alorich，HisTrapHP層析柱購自GEHealthcareLifeScience。

1.2基礎載體pET-TAT的構建根據NCBI，TAT序列（GenBank：AF525447）為tacggtcgtaaaaaacgtcgtcagcgtcgtcgt，人工合成后插入pET-32a（+）酶切位點SalI和XhoI之間。把pET-32a（+）質粒改造為pET-TAT基礎表達載體，由金思特科技（南京）有限公司完成。

1.3原核表達載體pET-EGFP的構建用限制性內切酶BamHⅠ和HindⅢ進行雙酶切重組質粒pMD18-T-EGFP和載體pET-32a（+），膠回收目的片段EGFP，T4連接到線性pET-32a（+），構建成表達載體pET-EGFP。

1.4原核表達載體pET-NLS-EGFP-TAT的構建根據EGFP序列，使用Oligo6.0設計N端加有核定位NLS序列的引物，上游引物：5′-CGCGGATCCCCGAAAAAGAAACGTAAAGTTACCATGGCTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3′，下游引物：5′-CCCAAGCTTCTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3′，（其中下劃線-部分分別為BamHⅠ和HindⅢ的酶切位點，下劃線波浪線部分為核定位NLS序列）。以pMD18-T-EGFP重組體為模板進行PCR擴增得到NLS-EGFP，然后進行TA克隆、酶切、連接到pET-TAT基礎表達載體上，構建成原核表達載體pET-NLS-EGFP-TAT。

1.5蛋白EGFP和NLS-EGFP-TAT的誘導表達將原核表達載體pET-EGFP和pET-NLS-EGFP-TAT分別轉化大腸桿菌BL21（DE3），當菌液濃度生長到OD值在0.6~0.8之后，添加IPTG終濃度為0.2mmol/L，37℃、220r/min搖床誘導4h，取樣進行SDS-PAGE分析。然后對陽性菌液進行大搖，離心收集菌液沉淀，再用溶菌酶消化、超聲波破碎菌體，得到粗制包涵體，再用含有1mol/L尿素的包涵體洗滌液超聲洗滌包涵體。

1.6融合蛋白的純化與復性洗滌后的包涵體，加入結合緩沖液，冰上充分冷卻，再4℃離心，收集上清液再用0.22μm濾膜過濾得到蛋白上柱樣品，然后將上柱樣品通過HisTrapHP層析柱，再用結合緩沖液洗去未結合上柱的蛋白及雜質，然后用復性緩沖液在層析柱上復性融合蛋白，含有咪唑的洗脫緩沖液洗脫融合蛋白，得到純化蛋白溶液。將純化蛋白溶液放入透析袋中，用MilliQ水中4℃透析，除去咪唑等，然后再在透析袋表面撒上PVP進行濃縮蛋白。

1.7細胞培養驗證穿膜功能水牛成纖維細胞接種培養24h后，更換培養液，然后在新的培養液中分別添加純化的EGFP蛋白（100μg/mL）和NLS-EGFP-TAT（100μg/mL）蛋白，繼續培養5~8h，在添加NLS-EGFP-TAT純化蛋白時，為了加強TAT的穿膜效果，同時在培養液中添加HA2-TAT蛋白。培養規定時間后，再用PBS充分洗滌細胞，然后在激光共聚焦顯微鏡下觀察EGFP蛋白分布狀態。

2結果

2.1原核表達載體的構建與鑒定雙酶切質粒pMD18-T-EGFP和載體pET-32a（+），得到EGFP片段，T4連接到線性pET-32a（+）上，構建為原核表達載體pET-EGFP，經酶切和PCR鑒定，結果與實驗設計相符，（見圖1和圖2）。通過引物帶入方式，PCR擴增得到NLS-EGFP片段，再經過TA克隆、酶切、連接到pET-TAT基礎表達載體上，構建為表達載體pET-NLS-EGFP-TAT，經酶切和PCR鑒定，結果與實驗設計相符（圖3和圖4）。

2.2融合蛋白的誘導表達由圖5可知，含有pET-EGFP和pET-NLS-EGFP-TAT的陽性BL21（DE3）菌液，經IPTG誘導后，分別在47.3ku和50.1ku處有特異性條帶，與預期相符。

2.3融合蛋白穿膜功能的初步檢測水牛成纖維細胞在添加EGFP蛋白共培養后，細胞的生長狀態并無影響，EGFP蛋白仍然散落在細胞培養液中；充分洗滌細胞后，并未觀察到細胞表面和細胞內有綠色熒光（圖6）。水牛成纖維細胞在添加了NLS-EGFP-TAT蛋白和HA2-TAT蛋白共培養后，可以觀察到NLS-EGFP-TAT蛋白很快吸附在細胞表面，在培養5~8h后，用PBS充分洗滌細胞3次，除去培養中多余的未穿膜蛋白，然后在激光共聚焦下可以觀察到細胞內均勻散布有熒光，說明NLS-EGFP-TAT蛋白已內化入細胞（圖7）。

3討論

Yamanaka等利用逆轉錄病毒載體在小鼠成纖維細胞中導入了4個因子（Oct4、Sox2、cMyc、Klf4），并用多能性標志分子Fbx15進行篩選，得到了iPS細胞，在這短短的幾年時間里，iPS細胞技術得到了迅速發展。但是這些iPS細胞的誘導方法大多數都是采用病毒載體、轉座子等，這些方法主要是采用了基因操作的原理來啟動細胞的重編程，可能導致基因插入突變，具有潛在的不安全性。隨后產生了更為安全可靠的方法，包括質粒轉導、小分子化合物誘導、蛋白誘導等等。其中蛋白誘導的方法充分利用了中心法則，采用干細胞轉錄因子的重組蛋白，利用細胞穿膜肽的作用將蛋白分子載入細胞內，從而啟動細胞重編程，獲得了安全性很高的iPS細胞。而采用蛋白誘導的方法想得到iPS細胞，關鍵是如何順利的將大分子物質（蛋白質）導入細胞內，并且定位于細胞核內作用于細胞DNA，充分的發揮其功能。因此本試驗重在引入細胞穿膜肽，將其與干細胞轉錄因子進行融合表達，從而獲得具有自主穿膜功能的重組蛋白。

Frankel等發現，從HIV-1（humanimmunodeficiencyvirus1）中純化出來的含有86個氨基酸殘基的反式活化因子蛋白—TAT蛋白（trans-activatorprotein，tat-86）能夠快速地順利穿過細胞膜。Vives等的研究表明，在TAT蛋白86個氨基酸殘基中，只需要其中的11個氨基酸殘基（tat：47-57），組成為YGRKKRRQRRR，即具有穿膜能力；并且推測其內化過程并不是依賴傳統的胞吞模式，以及非溫度依賴性。在對自然界存在的幾種穿膜肽（TAT、ANTP和VP22）的研究中，富含Arg、Lys等堿性氨基酸殘基，帶有大量正電荷，以及具有α-螺旋結構，而這些Arg和Lys就是影響其穿膜功能的必須氨基酸殘基。穿膜肽TAT的穿膜機制，目前還沒有一個公認的模式，但是基于CPPs的分子結構以及諸多的實驗驗證表明，CPPs首先是通過其α-螺旋表面的正電荷與細胞膜表面的負電荷物質（比如肝素、硫酸乙酰肝素、蛋白聚糖等等）發生靜電吸附，大量積聚在細胞表面，隨后由于某種機理而啟動的巨胞飲（macropinocytosis）通過不同的內化路徑（internalizationpathways）進入細胞。

采用蛋白誘導的方法順利得到水牛iPS細胞，另一個關鍵技術是如何將進入細胞內的干細胞轉錄因子活化蛋白定位于細胞核內。但是，對于穿膜肽TAT是否能將攜帶的外源蛋白進行亞細胞定位，在眾多的文獻報道中也各執一詞。對于大分子蛋白質要進出細胞核，現論認為其必須通過載體蛋白才能順利穿過核孔復合物（nuclearporecomlex，NPC）進入核內，而NLS（nuclearlocalizationsignal）序列則可以幫助大分子蛋白質與載體蛋白質結合成為聚合物，并提高其穿核效率。不同蛋白質轉運所依賴的NLS有所差異，并且其作用機制也不盡相同。根據Yoshikawa等的研究結果，融合表達NLS序列（氨基酸殘基序列為PKKKRKVTMA），可以準確地將目的蛋白（VENUS-TAT）定位于細胞核內。本實驗借鑒其方式，在引物中合成NLS序列，將其與EGFP-TAT蛋白融合表達，期望能夠使融合蛋白穿膜后因此具有細胞核內定位功能。從本實驗結果中，可以清楚地觀察到單獨添加EGFP蛋白只是分散在培養液中，并未發生細胞吸附現象，也未能在胞內檢測到熒光。而在細胞培養液中添加的NLS-EGFP-TAT蛋白，很快吸附在細胞表面，同時在培養液中添加了HA2-TAT蛋白，可以幫助NLS-EGFP-TAT蛋白在完成細胞內化后，能夠順利地從內含體中逃逸出來，避免被溶酶體降解掉，因此在細胞內可以檢測到熒光。但是NLS序列的引入，在試驗結果中并未有明顯的體現出來。由于蛋白質在復性折疊時，各組成結構相互影響的原理比較復雜，可能會直接造成蛋白質分子在構象修飾過程中，掩蓋了NLS結構，從而未能發揮出其較強的核定位功能。

4結論

本實驗成功的對EGFP蛋白和NLS-EGFP-TAT蛋白進行了原核表達，并添加到水牛成纖維細胞中進行共培養，能夠確定融合了TAT的EGFP蛋白能夠在TAT的幫助下順利進入細胞內。但想要進一步的將EGFP蛋白準確定位到胞核內，還需進一步的探討更合適的NLS序列及其在原核表達后蛋白折疊構象對其功能的影響，這樣才能為后續的制備蛋白誘導水牛iPS細胞奠定基礎。

作者：伏彭輝王一帆王玲羅宗剛單位：西南大學榮昌校區