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《光散射學(xué)報(bào)》2017年第2期

摘要：

固體支撐脂質(zhì)雙層膜能很好的模擬生物膜系統(tǒng)，固體襯底的表面結(jié)構(gòu)和性質(zhì)會影響雙層膜的成膜過程、流動性、微區(qū)形成以及化學(xué)活性，進(jìn)而影響蛋白的特性。本文，我們在兩種襯底云母和二氧化硅表面，構(gòu)建了包含神經(jīng)節(jié)苷脂GM1的固體支撐脂質(zhì)雙層膜，用拉曼光譜研究了兩種襯底表面脂質(zhì)膜的分子構(gòu)象。并且，在脂質(zhì)膜表面加入淀粉樣－beta蛋白，分析兩種襯底上淀粉樣－beta蛋白的構(gòu)象差異。

關(guān)鍵詞：

固體支撐脂質(zhì)雙層膜；Aβ蛋白；拉曼光譜；云母；二氧化硅

1引言

神經(jīng)節(jié)甘脂GM1（GM1）對于許多神經(jīng)系統(tǒng)中的細(xì)胞功能都有重要價(jià)值，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)元分化和軸突、樹突和突觸的形成。GM1由酰基鏈和一個復(fù)雜的頭基端組成［1－2］。研究表明，GM1會與淀粉樣－beta（Aβ）蛋白形成種子，可以促進(jìn)Aβ蛋白的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，從無規(guī)卷曲到α－h(huán)elix和β－sheet結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致Aβ蛋白形成寡聚體和纖維化，并且具有毒性。這種具有毒性的Aβ蛋白在阿爾茨海默癥（AD）中會引起神經(jīng)元細(xì)胞的死亡［3－11］。固體支撐脂質(zhì)雙層膜（SPBs）是很好的模擬生物膜系統(tǒng)，但固體襯底的表面結(jié)構(gòu)和性質(zhì)會影響雙層膜的成膜過程、流動性、微區(qū)形成以及化學(xué)活性。不同襯底上的脂質(zhì)膜對Aβ蛋白構(gòu)象的影響有很大差異，特別是含有GM1的脂質(zhì)體雙分子層。有報(bào)道研究了云母和二氧化硅（SiO2）表面包含GM1的脂質(zhì)膜與Aβ蛋白的相互作用。該研究通過原子力顯微鏡（AFM）觀察，在云母和SiO2表面SPBs的構(gòu)象有所差異，并且，在同等條件下云母表面Aβ蛋白聚集和纖維化的速度要大于SiO2表面的［12］。拉曼光譜可以提供有效的分子結(jié)構(gòu)信息。因?yàn)橐后w環(huán)境下水的拉曼散射比較弱，所以用拉曼光譜研究液體環(huán)境下的分子結(jié)構(gòu)更方便。但是拉曼散射效應(yīng)是很弱的，很容易被溶劑的熒光淹沒。最近，拉曼光譜在解決生物問題方面得到廣泛關(guān)注，已經(jīng)被成功運(yùn)用于檢測細(xì)胞成分和代謝活動。但是，因?yàn)橹|(zhì)雙層膜的厚度只有4～6nm，所以拉曼光譜很難被探測到。因此，一種復(fù)雜的結(jié)合拉曼光譜儀，顯微鏡和共聚焦系統(tǒng)的拉曼光譜系統(tǒng)被研發(fā)，該系統(tǒng)可以提高分辨率和信號采集效率，從而，可用于研究脂質(zhì)膜的拉曼光譜［13］。本文主要運(yùn)用拉曼光譜對比分析了兩種襯底云母和SiO2表面的GM1／SM／CholSPBs的分子構(gòu)象，以及加入Aβ蛋白后構(gòu)象變化的差異，從分子水平分析了襯底材料對脂質(zhì)雙層膜構(gòu)象的影響，以及對Aβ蛋白聚集速率的影響。

2實(shí)驗(yàn)方法

2．1材料和試劑單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂（GM1），膽固醇（Chol）和Amyloidbeta1－40（Aβ（1－40）購買自Sigma－Aldrich公司，鞘磷脂（SM）和C6－NBD－鞘磷脂（NBD－SM）購買自Avanti公司，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

2．2親水性基底的處理親水性基底SiO2是通過對Si（100）做濕氧化處理得到的，將Si（100）經(jīng)過一系列處理：H2SO4＋H2O2（30％）（容量比4∶1），HF（5％），進(jìn)而HCl＋H2O2（30％）＋H2O（1∶1∶4）。

2．3SPBs，單體Aβ（1－40）溶液的制備GM1、SM和Chol的摩爾比例為5／55／40和20／40／40。首先，取適量的GM1，SM和Chol分別溶于氯仿／甲醇（1∶1，v／v）混合溶液中，利用氮?dú)馐谷芤赫舭l(fā)，并在真空干燥箱中放置整夜，以形成干燥的膜，將干燥的混合磷脂溶于超純水中，達(dá)到最終濃度0．12mg／mL。將該混合溶液進(jìn)行冷凍－融化三次，后在60℃下超聲，最終得到磷脂囊泡溶液（SUVs）。制備用于觀察熒光的SUVs時(shí)，需要用NBD－SM對SUVs進(jìn)行熒光標(biāo)記，NBD－SM的濃度為1％（mol／mol）。制備好SUVs后，取200!LSUVs溶液滴到直徑10mm的新鮮固體襯底表面，在室溫下放置30分鐘，70℃放置15分鐘后冷卻到室溫。最后，用超純水清洗四遍移除未破裂的囊泡，所有的樣品都是在聚四氟乙烯的樣品池里制備。將Aβ（1－40）蛋白溶于0．02％的氨水溶液中，將溶液在14，000rpm，4℃下離心3h（BeckmanInstruments），得到單體的Aβ（1－40）蛋白，濃度為600!M，在－20℃下分裝儲存。使用時(shí)，將Aβ（1－40）溶液用緩沖液稀釋至100!M。

2．4熒光顯微鏡和拉曼光譜儀SPBs表面形貌的熒光圖像是在熒光顯微鏡（O－lympus）上觀察，經(jīng)CCD（NikonDS－2MBW）處理得到的。拉曼光譜是在WITECRSA300＋上測得，激發(fā)光源是632．8nm，光譜范圍是0～4000cm－1，累計(jì)時(shí)間是5s，物鏡放大倍數(shù)為100，光源功率低于0．5mW，從而避免激光對樣品造成破壞。

3結(jié)果和討論

3．120GM1／40SM／40Chol－SPBs在云母和SiO2上的表面形貌

我們用比例為20GM1／40SM／40Chol的SU－Vs溶液通過囊泡融合法在云母和SiO2表面形成平坦的SPBs。為了確認(rèn)形成了磷脂膜雙層的膜，我們用熒光顯微鏡對其形貌進(jìn)行觀察。圖1是云母和SiO2表面形成的SPBs的一系列熒光漂白恢復(fù)圖像（FRAP），a為云母表面的FRAP圖像，b為SiO2表面的FRAP圖像，進(jìn)行漂白后熒光還能恢復(fù)是因?yàn)镹BD－SM的橫向擴(kuò)散。可以看到在SiO2表面和云母表面都形成了非常平坦完整的SPBs，未破裂的囊泡量很少。如圖1所示，兩種基底上的SPBs都能實(shí)現(xiàn)熒光恢復(fù)。表明在兩種襯底表面，SPBs都處于液相狀態(tài)。這是因?yàn)橐合酄顟B(tài)的擴(kuò)散系數(shù)比凝膠狀態(tài)大幾個數(shù)量級，液相的SPBs熒光恢復(fù)時(shí)間比凝膠狀態(tài)快得多［14－15］。但是在5min時(shí)和10min時(shí)云母表面比SiO2表面熒光恢復(fù)較快，表明云母表面SPBs的流動性更好。

3．2GM1／SM／Chol－SPBs在云母和SiO2上的拉曼光譜

在云母和SiO2表面形成SPBs（20GM1／40SM／40Chol）后，直接對其進(jìn)行拉曼測試。圖2是云母和SiO2表面的SPBs的拉曼光譜，光譜a為云母表面的SPBs，b為SiO2表面。表1給出了拉曼光譜的峰值頻率和歸屬。C－C振動（1000～1200cm－1），如圖2A所示，光譜a和b的C－C伸縮振動區(qū)域1000～1150cm－1都相應(yīng)出現(xiàn)了幾個峰，這個區(qū)域有利于觀察磷脂雙層膜中酰基鏈的變化。對于酰基鏈的拉曼振動，已經(jīng)通過對磷脂膜的簡正坐標(biāo)分析和推論進(jìn)行過研究［16－18］。C－C振動對亞甲基鏈的的偏轉(zhuǎn)和全反式構(gòu)象很敏感，并且受亞甲基旋轉(zhuǎn)和變形影響很小。如果酰基鏈?zhǔn)侨词芥湥庾V將會出現(xiàn)1060cm－1（反對稱C－C伸縮）和1125cm－1（對稱C－C伸縮）兩個峰［18－19］。而1085cm－1譜帶歸屬于有偏轉(zhuǎn)缺陷的全反式［19］，光譜a，b中這個峰的出現(xiàn)表明在云母和SiO2基底表面形成的SPBs具有偏轉(zhuǎn)構(gòu)象，而不是“全反式”。在光譜圖2A光譜a中，1019cm－1來自于GM1中N－乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Ac）的C－C振動。GM1是含有唾液酸的糖脂，而Neu5Ac是唾液酸的主要形式，在GM1的頭端有Neu5Ac結(jié)構(gòu)［20］。而在光譜b中，因?yàn)镾iO2在～970cm－1處有很強(qiáng)的特征峰，從而將Neu5Ac的特征峰1019cm－1遮蓋，無法觀測到Neu5Ac的特征振動。我們在圖3中列出了云母和SiO2的拉曼光譜，其中圖3A對應(yīng)于云母的拉曼峰，圖3B對應(yīng)于SiO2。對于圖2A光譜a的特征峰1110cm－1，它既來自于磷脂分子C－C振動，也有來自云母基底的貢獻(xiàn)。因?yàn)樵颇冈?00～1110cm－1有豐富的振動峰（圖3A），在這個區(qū)域，我們也無法分析SPBs的構(gòu)象信息。另外，Si基底在～520cm－1和～970cm－1都有很強(qiáng)烈的特征峰（圖3B），將SPBs在該部分的分子振動特征掩蓋。因此，在SiO2表面的SPBs拉曼譜1060cm－1之前的區(qū)域，我們也無法分析SPBs的構(gòu)象。CH2扭轉(zhuǎn)／搖擺／彎曲（1200～1600cm－1）。這個區(qū)域來自于CH2的扭動／搖擺／彎曲模式。在圖2中，1295cm－1來自于CH2的扭轉(zhuǎn)，1374cm－1來自于CH2的搖擺［21－22］。另外，CH2彎曲的拉曼特征在光譜a和b中分別出現(xiàn)在1433cm－1和1454cm－1，這兩個峰只在六方晶相結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)［23］，表明磷脂分子是晶體結(jié)構(gòu)。并且，這個區(qū)域受分子內(nèi)和分子間費(fèi)米共振相互作用。對全反式酰基鏈的相關(guān)研究表明，搖擺的基本面（723～735cm－1）和未受擾動的彎曲的基本面（1442cm－1）之間的費(fèi)米共振，會在1433cm－1處產(chǎn)生一個很強(qiáng)的，在1454cm－1有一個弱的拉曼峰。然而，如果酰基鏈?zhǔn)菃涡被蛐狈骄担?418cm－1處還會出現(xiàn)拉曼峰［23－24］。因此，從SPBs的拉曼特征振動可知在云母和SiO2表面形成的SPBs（20GM1／40SM／40Chol）都處于六方晶相。CH2和CH3伸縮區(qū)域（2800～3000cm－1）。CH2和CH3伸縮振動的拉曼特征都出現(xiàn)在2800～3000cm－1。如圖3所示，譜帶2904cm－1（光譜a）和2902cm－1（光譜b）來自于νsFR（CH2）振動，2929cm－1（光譜a）和2926cm－1（光譜b）與νs（CH3）相關(guān)［14，25］，這兩個譜帶在光譜a和b中幾乎相同。另外，光譜a中，亞甲基的對稱和不對稱伸縮出現(xiàn)在2843和2878cm－1，光譜b中出現(xiàn)在2846和2878cm－1。從拉曼譜帶強(qiáng)度得出的參數(shù)可以用于估計(jì)脂質(zhì)雙層的分子間相互作用，2843cm－1和2880cm－1的峰強(qiáng)比，表示為I2878／I2843，反應(yīng)了鏈間橫向相互作用［14，25］。光譜b中I2878／I2846比值比光譜a中I2878／I2843略大，這表明SiO2表面的SPBs橫向鏈間相互作用比云母表面的略大，SPBs流動性較小，這與FRAP結(jié)果相一致。

3．3云母和SiO2上SPBs加入Aβ（1－40）后的拉曼光譜

為了研究不同基底材料對Aβ（1－40）和SPBs相互作用的影響，我們在云母和SiO2上形成GM1／SM／CholSPBs后，直接在其表面加入100!M的單體Aβ（1－40）溶液，Aβ（1－40）的最終濃度為1!M，將樣品池37℃下恒溫放置12h，之后進(jìn)行拉曼測試。如圖4所示，光譜a代表云母表面的拉曼光譜，光譜b代表SiO2表面的拉曼光譜，圖4A是1000～1800cm－1區(qū)域的拉曼光譜，圖4B對應(yīng)于2800～3000cm－1區(qū)域。如圖4A光譜a所示，相比于云母上的SPBs的拉曼譜（圖2A光譜a），加入Aβ（1－40）后，SPBs的拉曼光譜1019cm－1幾乎消失，我們將這個變化歸因氨基酸和GM1頭端的Neu5Ac可能發(fā)生了直接相互作用。另外光譜a和b都出現(xiàn)了新的峰1260cm－1，它對應(yīng)于Aβ（1－40）蛋白amideIII的α－螺旋結(jié)構(gòu)。這個峰的出現(xiàn)表明，此時(shí)在兩種基底上Aβ（1－40）都發(fā)生了無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)到α－螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變。另外，光譜a中，1374cm－1發(fā)生輕微偏移至1381cm－1，它既代表磷脂分子CH2擺動，又與多肽的amideS結(jié)構(gòu)有關(guān)（amideS的出現(xiàn)與β－折疊結(jié)構(gòu)相關(guān)）［26］。在1410cm－1出現(xiàn)新的譜帶，可以歸屬于Aβ（1－40）的酪氨酸殘基［27］。這兩個峰的變化在光譜b中都沒有表現(xiàn)。光譜a和b的差別表明，在兩種基底上，Aβ（1－40）都表現(xiàn)出了α－螺旋結(jié)構(gòu)，云母表面Aβ（1－40）已經(jīng)聚集并出現(xiàn)了β－折疊結(jié)構(gòu)和氨基酸殘基的信號峰，而在SiO2表面卻還沒有表現(xiàn)出來。從圖4B中2800～3000cm－1光譜區(qū)域分析發(fā)現(xiàn)，在云母表面的拉曼光譜發(fā)生了很大變化，而在SiO2表面這個區(qū)域的拉曼峰與圖2中幾乎一樣。與圖2B中云母表面（光譜a）相比，2846，2878cm－1偏移至2845和2881cm－1，比值I2881／I2843變大。這說明，加入Aβ（1－40）12h后，SPBs的鏈間橫向相互作用變大，SPBs趨向于凝膠狀態(tài)。另外，來自于νsFR（CH2）的2904cm－1偏移至2901cm－1并且峰強(qiáng)明顯變大。2929cm－1（νs（CH3））減弱幾乎消失，2962cm－1（νa（CH3））增強(qiáng)很多，這兩個峰屬于SPBs疏水部分的甲基頭端。這些變化表明在云母表面Aβ（1－40）與SPBs疏水端的相互作用，疏水鏈包含酰基鏈和甲基頭端。而在SiO2表面Aβ（1－40）與SPBs相互作用速度較慢，此時(shí)Aβ（1－40）沒有進(jìn)入到疏水部分。隨著Aβ（1－40）加入時(shí)間增加，拉曼光譜繼續(xù)發(fā)生變化，圖5表示的是在SPBs表面加入Aβ（1－40）24h后的拉曼光譜。光譜a為云母表面的拉曼光譜，光譜b代表SiO2表面的拉曼光譜。圖5A是1000～1800cm－1區(qū)域的拉曼光譜，圖5B是2800～3000cm－1區(qū)域的拉曼光譜。在云母表面，與12h的拉曼光譜相比，24h的光譜a又有幾個新的峰出現(xiàn)，1003，1188，1211和1240cm－1。其中，1003cm－1處窄的強(qiáng)的譜帶來自于Aβ（1－40）的苯丙氨酸，1188cm－1和1211cm－1可以歸屬于Aβ（1－40）的酪氨酸［27］。這幾個來自氨基酸殘基的拉曼特征峰在光譜b中都沒有出現(xiàn)。我們可以將這兩種氨基酸強(qiáng)度的增加歸因于隨著蛋白加入時(shí)間增加，說明Aβ（1－40）在云母表面比在SiO2表面聚集更多。光譜a中，amideIII（1230～1300cm－1）的拉曼信號出現(xiàn)在1240cm－1，光譜b中在1244cm－1，對應(yīng)于amideIII的β－折疊結(jié)構(gòu)［28］。與此同時(shí)，光譜a中代表amideIII的α－螺旋結(jié)構(gòu)出現(xiàn)在1260cm－1，光譜b中出現(xiàn)在1268cm－1處［28］。光譜a中表示CH2扭轉(zhuǎn)的1300cm－1比圖4中a強(qiáng)度更強(qiáng)，這可能是因?yàn)锳β（1－40）對SPBs酰基鏈的亞甲基產(chǎn)生了影響。Aβ（1－40）的amideI（1590～1725cm－1）在1656cm－1的強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，那是因?yàn)锳β（1－40）蛋白發(fā)生了更多的聚集和構(gòu)象轉(zhuǎn)變。在光譜b中，1202cm－1，1656cm－1強(qiáng)度增加幅度較小。說明SiO2表面Aβ（1－40）聚集程度比云母上小。對于2800～3000cm－1區(qū)域（圖5B），與圖4B中a相比，CH振動強(qiáng)度整體增強(qiáng)幅度較大，2845，2881cm－1偏移至2849和2874cm－1，并且I2874／I2849比圖4中I2881／I2843大。且2902和2962cm－1明顯增強(qiáng)。這說明隨著Aβ（1－40）加入更長時(shí)間，云母表面聚集更多Aβ（1－40），并且蛋白與SPBs疏水端作用更強(qiáng)烈，SPBs趨向于凝膠狀態(tài)，膜在一定程度被破壞。而光譜b中無論是峰強(qiáng)及峰位變化都較小。表明在SiO2表面Aβ（1－40）聚集以及與SPBs疏水端的相互作用程度比較弱。從上述結(jié)果可以看到，由于襯底的作用，導(dǎo)致SiO2表面上形成的脂質(zhì)雙層膜的流動性較小，橫向鏈間相互作用較大。另外GM1是含有唾液酸的糖脂，Neu5Ac是唾液酸的主要形式，它的特征峰1019cm－1只出現(xiàn)在云母襯底上，并且在加入Aβ后這個特征峰的消失表明Neu5Ac與Aβ蛋白的直接相互作用。這些證明了在云母上GM1的Neu5Ac功能團(tuán)很可能是暴露在上面的，而且由于較好的流動性很可能使得GM1聚集形成了團(tuán)簇。暴露在表面的聚集的Neu5Ac通過發(fā)生CH－π相互作用綁定Aβ，但是在SiO2襯底上團(tuán)簇的形成較為困難，Neu5Ac也可能不是暴露在膜表面的，所以對Aβ的綁定相對較少。這從酪氨酸和苯丙氨酸的特征振動沒有出現(xiàn)，而且α－螺旋結(jié)構(gòu)和β－折疊結(jié)構(gòu)的特征振動峰相對較弱也可以證明，說明Aβ（1－40）在SiO2表面比在云母表面聚集的少，使Aβ構(gòu)象轉(zhuǎn)變相對較慢。另外在SiO2表面脂質(zhì)雙層膜疏水端的變化也比較緩慢，而云母表面隨著Aβ（1－40）加入更長時(shí)間，蛋白與SPBs疏水端作用強(qiáng)烈，SPBs趨向于凝膠狀態(tài)，膜在一定程度上被破壞。Aβ（1－40）與SPBs相互作用是通過疏水性C終端插入雙層膜中與脂質(zhì)體的疏水性酰基鏈相互作用，很可能因?yàn)镾iO2表面有較大的橫向相互作用，C終端的插入相對比較困難，所以SiO2襯底上GM1／SM／CholSPBs的疏水端在Aβ蛋白的作用下基本上沒有變化。

4結(jié)論

GM1，SM和Chol是等離子膜脂筏的主要成分，這些脂筏被對信息傳導(dǎo)，細(xì)胞運(yùn)輸脂質(zhì)排序起到重要作用，經(jīng)常作為細(xì)胞膜模擬體系用于研究。固體支撐脂質(zhì)雙層膜是很好的模擬生物膜系統(tǒng)，但固體襯底的表面結(jié)構(gòu)和性質(zhì)會影響脂質(zhì)膜的成膜過程、流動性、微區(qū)形成以及化學(xué)活性。在本論文中，利用囊泡融合法在云母和SiO2表面都形成了平坦均勻的GM1／SM／CholSPBs，通過拉曼光譜分析云母表面的SPBs流動性比SiO2表面要好，從分子水平上分析了基底材料對磷脂分子構(gòu)象的影響。加入Aβ蛋白后，不同時(shí)間的拉曼光譜表明基底材料對蛋白構(gòu)象變化有所影響。Aβ蛋白在SiO2表面比在云母表面聚集的少，使Aβ蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變相對較慢。在SiO2表面，Aβ蛋白與脂質(zhì)雙層膜疏水端作用比較緩慢。而在云母表面，隨著Aβ加入的增加，蛋白與SPBs疏水端相互作用比SiO2強(qiáng)烈。

作者：胡智萍 王肖麗 張振龍 程秀英 毛艷麗 單位：河南大學(xué)物理與電子學(xué)院 河南大學(xué)計(jì)算材料科學(xué)研究所