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《免疫學(xué)雜志》2016年第二期

[摘要]

目的構(gòu)建、表達(dá)和純化相思子毒素B（ATB）鏈蛋白并分析其抗原性和毒性。方法運用密碼子優(yōu)化軟件優(yōu)化ATB基因，合成目的基因亞克隆至原核載體pQE-80L構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pQE80L-ATB，轉(zhuǎn)化至E.coliM15獲得表達(dá)工程菌株，并對誘導(dǎo)表達(dá)條件和純化條件進(jìn)行優(yōu)化；通過Westernblot檢測重組蛋白的抗原性；采用人正常肺上皮細(xì)胞Beas-2B和胃黏膜細(xì)胞GES-1進(jìn)行重組蛋白的細(xì)胞毒性實驗。結(jié)果ATB開放閱讀框架全長804bp，編碼268個氨基酸殘基；表達(dá)工程菌株在30℃、1mmol/LIPTG，3h后獲得包涵體形式表達(dá)的目的蛋白，相對分子質(zhì)量均約為30000，經(jīng)Ni-NTA親和層析柱純化后純度達(dá)97%以上，Westernblot和MTS實驗結(jié)果表明，目的蛋白能特異性識別抗相思子毒素多克隆抗體且無毒性。結(jié)論重組ATB蛋白實現(xiàn)高表達(dá)，具有良好的抗原性，為相關(guān)疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]

相思子毒素B鏈；抗原性；生物恐怖

相思子毒素（abrintoxin，AT）是來源于相思子（Abrusprecatorius）的一種細(xì)胞毒性蛋白，由A鏈（ATA）和B鏈（ATB）2條多肽鏈通過二硫鍵組成，其中A鏈呈酸性，為毒性單位；B鏈呈中性，為結(jié)合單位[1-2]，小鼠腹腔LD50約為0.04μg/kg[3-4]。由于AT具有天然資源豐富、制備容易、中毒后無特異癥狀等特點，因此很容易被恐怖分子作為生物恐怖劑使用[4]，也是我國新形勢下反恐工作的重要組成部分。目前，針對毒素中毒免疫預(yù)防措施主要包括疫苗主動免疫接種[1,5]和應(yīng)用抗體進(jìn)行治療[3,6]2方面，由于中和性抗體只能產(chǎn)生短期的被動免疫保護(hù)效果，因此有效的方法是使用預(yù)防性疫苗。AT相關(guān)生防疫苗的研究較少，包括甲醛化的類毒素[5]和基于A鏈蛋白的疫苗[1]，但二者的使用受限于毒性問題。同時，文獻(xiàn)報道B鏈亞單位同樣具有很好的免疫原性[7-11]，而且其他相關(guān)報道顯示作為AT的候選疫苗，B鏈亞單位具有獨特的優(yōu)勢[12]。首先，如破傷風(fēng)、霍亂毒素、白喉等其他的A-B家族毒素已經(jīng)采用其各自的B亞單位制備疫苗并被證明是有效的；其次，由于ATB能特異性的結(jié)合到M細(xì)胞表面，因此具有佐劑活性；最后，相思子毒素的B鏈?zhǔn)菬o毒的，因此作為疫苗應(yīng)用于人體就不存在毒性的問題。本研究旨在利用原核表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)重組ATB蛋白；分析重組蛋白的抗原性和細(xì)胞毒性，為篩選抗AT中毒的疫苗研制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1菌株、質(zhì)粒與細(xì)胞pMD18-T載體購自TaKaRa公司；含有目的基因的質(zhì)粒pUC-ATB由生物公司合成；原核表達(dá)載體pQE-80L購自Qiangen公司；宿主菌E.coliDH5α和M15、人正常肺上皮細(xì)胞Beas-2B和胃黏膜細(xì)胞GES-1為本實驗室保存。

1.2主要試劑2×KODPCR反應(yīng)試劑（KODDNA聚合酶、PCRBuffer、dNTP混合物）、DL2000核酸Marker、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ購自大連TaKaRa公司，質(zhì)粒提取試劑盒為北京天根生物公司產(chǎn)品，5ml鎳預(yù)裝柱購自GEhealthcare公司，山羊抗兔IgG購自SantaCruz公司，抗天然AT兔多克隆抗體由本實驗室制備，細(xì)胞毒性試驗檢測試劑盒購自Sigma公司，其它化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3編碼序列的優(yōu)化與合成天然AT有a、b、c、d4種亞型，a亞型的細(xì)胞毒性最強(qiáng)，本研究選取a亞型的氨基酸序列。運用Condonopt軟件，采用GenBank檢索登錄號1908235A優(yōu)化ATB基因，并在上、下游分別含BamHI、HindⅢ酶切位點，由南京金斯瑞公司合成，獲得pUC-ATB/E.coliTop10F’。

1.4目的基因表達(dá)載體的構(gòu)建BamHI和HindⅢ雙酶切克隆測序載體pUC-ATB和表達(dá)載體pQE-80L，膠回收后在16℃、T4DNA連接酶條件下過夜連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pQE80L-ATB，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至CaCl2法制備的E.coliM15感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建重組表達(dá)菌株M15/pQE80L-ATB，PCR篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.5重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和表達(dá)形式的確定經(jīng)PCR和酶切鑒定正確后，挑新鮮單菌落M15/pQE80L-ATB以1∶100轉(zhuǎn)接于10ml的Amp抗性的LB培養(yǎng)基（100μg/ml）37℃過夜培養(yǎng)。次日按1∶100比例轉(zhuǎn)接于500ml含Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基，于37℃200r/min振搖培養(yǎng)3~4h至OD600nm為0.6~0.8時，加IPTG至終濃度1mmol/L，30℃誘導(dǎo)5h。8000g4℃離心5min收集菌體，沉淀用0.01mol/LPBS洗后重懸，于冰上超聲破碎后，收集上清及沉淀。行凝膠電泳鑒定，并用考馬斯亮藍(lán)染色觀察結(jié)果。

1.6重組蛋白的純化和定量按1.5方法進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，離心收集后將沉淀用0.01mol/LPBS洗滌2次，再分別用2%Tritox-X100、2%Tween-20、1mol/LNaCl、2mol/L尿素各洗滌3次，然后加入BufferA（20mmol/LPB、500mmol/LNaCl、50mmol/L咪唑，8mol/L尿素，pH8.0），并上樣到Ni柱中，經(jīng)咪唑洗脫后收集蛋白目的峰。將收集的蛋白進(jìn)行梯度透析復(fù)性，分別經(jīng)4、2、1、0.5mol/L尿素和PBS緩沖液，4℃條件下攪拌48h以上，并用PEG20000濃縮。行SDS-PAGE電泳分析純度，采用BCA法定量。

1.7重組蛋白Westernblot分析行凝膠電泳rATB蛋白和M15/pQE80L空質(zhì)粒表達(dá)的菌體蛋白，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜。將轉(zhuǎn)好的硝酸纖維素薄膜于3%BSA封閉液中37℃封閉1h，用洗滌液振蕩洗膜3min/次，共3次。抗天然AT兔多克隆抗體（一抗，稀釋度為1∶1000）室溫孵育1h后洗膜3次。再用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（二抗，稀釋度為1∶50000）室溫孵育1h，洗膜3次后經(jīng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像。

1.8重組蛋白毒性分析采用MTS試劑盒測定重組蛋白rATB和天然AT對人正常肺上皮細(xì)胞Beas-2B和胃黏膜細(xì)胞GES-1的殺傷作用。1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人正常肺上皮細(xì)胞Beas-2B并計數(shù)為（1~2）×104/孔，DMEM培養(yǎng)基胃黏膜細(xì)胞GES-1并計數(shù)，分別以100μl/孔加入96孔板中。空白孔只加細(xì)胞培養(yǎng)基。37℃5%CO2培養(yǎng)箱中生長24h；分別用2種培養(yǎng)基對測定蛋白（分別為rATB或天然AT）進(jìn)行5倍稀釋后加入100μl/孔（rATB的質(zhì)量濃度為1000、200、40……0.0001ng/ml；AT的質(zhì)量濃度為20、4、……0.00001ng/ml），陰性對照孔不加毒素；96孔板至5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃，培養(yǎng)72h；PBS洗板3遍后96孔板依次先后加入100μl培養(yǎng)基和20μl試劑盒自帶的MTS，并在37℃條件下培養(yǎng)2h；MultiskanMk3酶標(biāo)儀上讀取A490nm值并計算細(xì)胞生存率。

2結(jié)果

2.1重組質(zhì)粒pQE80L-ATB的構(gòu)建和鑒定優(yōu)化ATB基因序列成大腸桿菌高頻密碼子，ATB全長786bp，編碼268個氨基酸殘基。用BamHI/HindⅢ對重組質(zhì)粒pQE80L-ATB進(jìn)行酶切鑒定和PCR鑒定。圖1結(jié)果顯示成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pQE80L-ATB。

2.2重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)M5/pQE80L-ATB工程菌在沉淀中出現(xiàn)大量目的蛋白，相對分子質(zhì)量約為30000（圖2a），表達(dá)量約占73.43%。經(jīng)Ni柱純化，目的蛋白在含500mmol/L咪唑洗脫液中被洗脫下來（圖2b），純化后的純度為97%左右。經(jīng)復(fù)性、濃縮后質(zhì)量濃度約為0.832mg/ml。

2.3重組蛋白的抗原性分析免疫印跡顯示，純化后的rATB蛋白能特異性的與抗天然AT兔多抗體發(fā)生反應(yīng)（圖3），說明目的蛋白具有特異的抗原性。

2.4重組蛋白的毒性分析MTS法測定rATB對細(xì)胞毒性實驗表明，rATB對人正常肺上皮細(xì)胞Beas-2B和胃黏膜細(xì)胞GES-1是無毒性的，這與文獻(xiàn)報道相一致；同時細(xì)胞存活曲線圖4表明天然AT對Beas-2B的IC50約為0.16ng/ml，圖5顯示GES-1的IC50約為0.032ng/ml。

3討論

AT是植物來源的蛋白毒素，屬于Ⅱ型核糖體失活蛋白（RIP），其毒性是普通化學(xué)武器的幾百倍，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的毒性最強(qiáng)的植物毒素之一[1]，發(fā)展有效的防治手段已成為各國生防領(lǐng)域的重要研究任務(wù)，而主動免疫是一種預(yù)防毒素中毒的有效方法。目前關(guān)于AT相關(guān)的生防疫苗研制較少。其中，類毒素是將天然毒素經(jīng)甲醛化處理后可以保護(hù)免疫動物的致死劑量毒素中毒[5]，由于具有一定毒性而未有進(jìn)一步的發(fā)展。2008年，Surendranath等[3]報道了一種中和性IgG單抗（D6F10），可以在細(xì)胞內(nèi)或小鼠體內(nèi)抑制AT中毒。2011年，我室Han等[1]采用定點突變技術(shù)獲得ATA突變體（mABRAE164AR167L），能抵抗10×LD50劑量的天然毒素攻毒，顯示出良好的免疫原性。

關(guān)于毒素B鏈的免疫原性則存在爭議，有文獻(xiàn)報道B鏈的免疫原性不如A鏈[8-10,13-16]，不適合做疫苗候選。但也有研究者認(rèn)為證明B鏈亞單位同樣具有很好的免疫原性，而且其他毒素的B鏈蛋白已被證明是一種良好的疫苗候選抗原[12]。此外，B鏈蛋白在毒素中發(fā)揮結(jié)合鏈作用，因此在缺乏A鏈的情況下，B鏈蛋白是無毒性的，這也是B鏈蛋白疫苗優(yōu)于基于A鏈蛋白或全毒素疫苗的優(yōu)勢。本研究首先應(yīng)用密碼子優(yōu)化軟件Condonopt對ATB進(jìn)行基因優(yōu)化，替換大腸桿菌稀有密碼子為高頻密碼子，并成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pQE80L-ATB，重組蛋白以包涵體形式存在，且相對分子質(zhì)量均約為30000，采用Ni-NTA親和層析柱純化，蛋白純度均達(dá)97%以上。經(jīng)免疫印跡實驗驗證，rATB可與相應(yīng)的抗天然AT兔多克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，MTS細(xì)胞毒性試驗結(jié)果表明rATB無毒性，這與文獻(xiàn)報道相一致[11]。總之，本研究在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中獲得rATB的高效表達(dá)，重組蛋白無毒性且保留了良好的抗原性，為下一步研究相思子B鏈疫苗奠定了基礎(chǔ)。

作者：王俊虹 楊帆 魏茂提 單位：天津市職業(yè)與環(huán)境危害防制重點實驗室 武警后勤學(xué)院救援醫(yī)學(xué)系部隊衛(wèi)生統(tǒng)計和流行病學(xué)教研室