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《免疫學雜志》2016年第二期

[摘要]

目的通過研究VC處理過的DC細胞在過繼免疫T細胞培養中是否發揮促進作用，進一步探討維生素C對于免疫調控的作用機制，同時為制備非特異性CTL提供方法及思路。方法采集健康志愿者外周血50ml，用淋巴細胞分離液分離外周血PBMC，貼壁后獲得單核細胞。用VC對DC進行孵育（24h）后經PBS洗滌，培養5d后與添加anti-CD3+單抗的T細胞混合培養至第12天，同時設立空白對照組（noneDC組、0mmol/LVC-DC組）。流式細胞儀檢測T細胞亞群及細胞因子分泌情況。LDH法檢測VC對DC-T細胞非特異性殺傷情況。結果VC處理的DC細胞可顯著刺激T細胞成熟，其CD8+CD28+及CD40L表型有顯著升高（61.23%±6.78%，68.87%±4.37%），同時發現Treg細胞明顯降低（4.51%±1.22%）。細胞因子分泌情況分析結果顯示，vcDC可促進T細胞因子分泌，IFN-γ、IL-2有顯著升高（32.29%±3.26%，19.66%±4.37%），IL-4有顯著降低（3.36%±1.29%）。殺傷結果顯示對不同腫瘤細胞非特異性殺傷有明顯增強。結論VC通過致敏DC進而可激活T細胞向非特異性CTL（CD8+CD28+）分化，提高T細胞因子分泌能力。

[關鍵詞]

維生素C；樹突狀細胞；T細胞亞群；非特異性T淋巴細胞毒性效應

維生素C是一種有效防止氧化損傷的抗氧化劑，可清除細胞內氧化自由基（O-）[1]。生理范圍下，維生素C在血清中的含量一般在70~100μmol/L。研究顯示，靜脈注射3g維生素C，其受注者血清中VC的含量可達到1700μmol/L，但是如果患者口服相同劑量，血液中VC含量僅達220μmol/L[2]。我課題組前期研究顯示，高濃度VC可致敏DC細胞成熟，且當VC為1mmol/L時對DC細胞刺激效果最佳，顯著提升DC細胞的成熟度及表面標志物比例。據研究顯示VC可作為一種抗腫瘤前體物質調控腫瘤細胞凋亡及抑制生長，大劑量的VC（約5mmol/L）可引起腫瘤細胞的凋亡，當黑色素瘤細胞B16F10暴露在VC中時[3-4]，VC可引起細胞色素C釋放進而引起線粒體酶減少。還有研究顯示，VC可通過下調CD71（轉鐵蛋白）的表達進而降低細胞對金屬離子（鐵離子）的攝入，后者被認為是維持腫瘤細胞活性必要的因素之一[5]；而低劑量的VC（小于1mmol/L），又可通過調節Chk2-p53-p21Waf1/Cip1途徑以及影響細胞膜上受體生長因子，如胰島素樣生長因子（IGF）-1等來抑制腫瘤細胞增殖[6]。同時，對于VC的抗腫瘤機制又有了新的發現，VC可以通過抑制血管內皮生長因子（VEGF）的表達而抑制腫瘤血管生成[6]。而另據Chen等[7]研究認為VC抗腫瘤機制可能是VC會釋放游離過氧化氫，直接作用于腫瘤細胞DNA干擾腫瘤細胞周期，誘導腫瘤細胞凋亡。但VC作為免疫調控物質的研究卻鮮有報道。Hwang等[8]研究顯示，VC可顯著刺激CD4+T細胞分化，并提高Th1型細胞比例，同時釋放大量IL-12，而據其另一篇報道顯示[1]，VC還可提高CD8+memoryT細胞比例。但VC在過繼免疫細胞培養過程中如何發揮作用尚未有所報道，本文就VC致敏處理過的DC細胞與T淋巴細胞混合培養，并對T細胞亞群變化及細胞因子變化等情況進行分析。

1材料與方法

1.1試劑耗材維生素C（VC）（Sigama公司），RhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-α（Peprotech公司），10%胎牛血清（杭州四季青），RPMI1640（Scientific公司），FITC標記CD86mAb、PE標記CD80mAb、APC標記MHC-IIDR、FITC標記CD40mAb、PE標記CD40L（CD154）mAb（BD公司）。Ficoll分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責任公司）。

1.2儀器設備倒置顯微鏡（奧林巴斯），CO2細胞培養箱（Thermo），臺式冷凍離心機（湖南湘智），臺式高速離心機（Eppondorf），流式細胞儀（BD公司），生物安全柜（新加坡ESCO）。

1.3細胞分離采集健康志愿者外周血50ml與PBS溶液按照1∶4混合均勻，將稀釋后的血液以1∶1比例緩慢加入淋巴細胞分離液上方。于4℃、700g離心15min。小心吸取單個核細胞層，加入另一離心管中，并用4倍體積PBS洗滌250g離心5min，去除淋巴細胞分離液。PBS洗滌2次即獲得外周血單核細胞。

1.4DC細胞培養外周血單核細胞懸浮于1640培養基中，調整細胞數為1×108/ml，于48孔細胞培養板上貼壁。在37℃、5%CO2培養箱中培養3~6h貼壁后，收集懸浮細胞，貼壁細胞PBS蕩洗2次后為DC前體細胞，于倒置顯微鏡下觀察計數，加入1640培養基：GM-CSF（800U/ml）和IL-4（1000U/ml），調整細胞數約為1×106/ml并繼續培養。

1.5T淋巴細胞培養外周血單核細胞分離貼壁后，收集未懸浮細胞于1640培養基中（10%FBS），調整細胞數為1×107/ml，加入到包被有anti-CD3+單克隆抗體的細胞培養瓶中，37℃、5%CO2培養箱中培養。1.6不同濃度VC對DC的影響于DC孔板細胞培養液中加入不同濃度VC，濃度梯度為0、50、500μmol/L、5mmol/L。DC細胞貼壁洗滌后，加入上述濃度VC（RPMI-1640，10%FBS,GM-CSF800U/ml和IL-41000U/ml）孵育24h后洗滌，之后加入培養液RPMI-1640、10%FBS、GM-CSF800U/ml和IL-41000U/ml培養。于第5天將DC與T細胞混合培養至第14～15天。

1.7T細胞增殖、表型及細胞因子分泌水平檢測不同濃度VC處理的DC細胞于第5天與T細胞（1×107）混合，混合比例1∶10，連續培養至第20天，期間在第5、10、15、20天檢測T細胞數量并作分析。于第15天檢測細胞表型，用Percp-CD3mAb、FITC-CD4mAb、APC-CD8mAb、PE-CD28mAb、APC-CD25mAb/CD127mAb、PE-CD40L（CD-154）mAb標記T細胞30min。之后用流式細胞檢測儀進行表型檢測。檢測CD8+T細胞分泌細胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ水平。

1.8LDH法檢測vcDC-T對腫瘤細胞株殺傷活性復蘇腫瘤細胞株k562、A549、DLD1，調整細胞數，以不同效靶比與T細胞混合，室溫下殺傷4h，LDH法檢測T細胞對腫瘤細胞株殺傷能力。

1.9統計學分析數據均以均數±標準差表示，應用SPSS21軟件，兩樣本均數的比較采用配對的t檢驗，多樣本均數的比較采用方差分析，方差不齊用秩和檢驗，檢驗水準α=0.05。P<0.05認為差異有統計學意義。

2結果

2.1vcDC可促進T細胞增殖我課題組之前研究結果顯示，VC可顯著提高DC細胞表面共刺激分子及CD40表達，并且隨著VC的濃度呈現梯度依賴性和時間依賴性，且濃度為1mmol/L時VC對DC細胞的刺激作用最明顯，培養最佳時間為3d。因此本實驗VC濃度為1mmol/L（0mmol/LVC組及無DC組為空白對照組），處理DC24h后經PBS洗滌2次，更換至1640培養液中繼續培養5d。與T細胞混合連續培養至第20天，T細胞增殖曲線（圖1a）結果顯示，在CD3+單克隆抗體存在的前提下，T細胞有顯著增殖，但由VC-DC引起的T細胞增殖并不明顯（P>0.05）無統計學差異；而在CD3+單克隆抗體不存在時，檢測到T細胞增殖可受VC影響（圖1b）（P<0.05），結果有統計學意義。這提示VC確實可通過激活DC細胞進而刺激T細胞增殖。

2.2vcDC可促進CD8+CD28+T細胞增殖及CD40L表達將DC細胞與T細胞混合培養至第15天，檢測T細胞CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD8+CD28+及CD40L表型。圖2結果顯示，3組中CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+沒有顯著差異，這很可能因為anti-CD3+單克隆抗體的添加使得CD3+T細胞被顯著刺激，且T細胞亞群中主要以CD3+CD8+亞群為主（80.4±%3.32%），但同時結果顯示CD40L、CD8+CD28+比例卻有顯著不同，表現為VC-DC組二者有顯著提高。本課題組之前研究已證明，VC除可顯著提高DC細胞表型外還可有效刺激CD40表達，而當DC與T細胞混合后CD40可激活T細胞表面CD40L表達（68.87%4.37%）同時活化T細胞CD8+CD28+比例提高（61.23%±6.78%）。

2.3vcDC可顯著降低CD4+CD25+CD127lo/-(Treg)細胞比例為考察負性調節T細胞（Treg）亞群表達情況，本文檢測了CD4+CD25+CD127lo/-細胞比例，圖3結果顯示，VC-DC組Treg比例明顯降低，說明VC-DC可降低T細胞亞群中負性調節細胞分化。

2.4vcDC與T細胞共培養可顯著提高CD3+CD8+細胞因子分泌能力經anti-CD3mAb激活的T細胞，其亞群中主要以CD3+為主，其中CD3+CD8+比例占到80%以上，因此我們考察了VC濃度為0.5mmol/L時DC誘導CD3+CD8+細胞亞群分泌細胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ表達比例。流式結果顯示，VC-DC組T細胞中CD3+CD8+細胞分泌細胞因子能力明顯高于未經處理的DC組（圖4a、b），表明VC可通過致敏DC進而激活T細胞，刺激非特異性CTL產生。之后我們做了不同濃度VC對DC-T細胞因子誘導情況分析，結果顯示，在VC的生理濃度范圍內（0.05～2mmol/L），VC可顯著刺激DC成熟（此部分研究結果已發表），進而誘導T細胞提高細胞因子分泌能力（圖4c），而當VC濃度顯著過高時，表現出一定程度的細胞毒性效應（圖3c，5mmol/LVC-DC組）。這也提示我們，VC的用量并非越大越好，高濃度大劑量VC的使用可能會對免疫系統造成一定程度的危害。

2.5vcDC可提高T細胞對腫瘤細胞的殺傷活性為考察VC-DC組與未處理DC組混合培養的T細胞對不同種類腫瘤細胞株殺傷能力。選擇效靶比20∶1，殺傷時間4h。殺傷結果顯示（圖5），VC-DC組T細胞殺傷活性有所提高，上述結果說明，VC作為一種重要的功能性小分子物質，在免疫調控中發揮重要作用，而對于過繼免疫細胞治療，特別是以DC為誘導的DC-T細胞治療，VC可通過快速誘導DC成熟，刺激DC表面二類分子活化，促進CD40表達，進而激活T細胞，使得非特異性CTL效應顯著提高。

3討論

維生素是人體必需的一族小分子化合物，在機體的發育、生長、細胞分化等生物學過程中發揮重要作用，其中以維生素C最具代表[9]。維生素C又稱抗壞血酸，是一類具有強還原效應的維生素，對機體內保持細胞氧化-還原微環境的平衡、抵抗氧自由基（O-）[10]起到關鍵作用。研究顯示，氧化還原作用（Redox）[10-11]對機體生理學效應非常顯著，而在炎癥誘導的腫瘤微環境[12]中也起到至關重要的作用，這包括炎癥的發生，慢性炎癥導致的組織癌變[12]，腫瘤的發生、發展，腫瘤抗原二聚化（多聚化）對腫瘤細胞免疫原性的調節，免疫防御系統的調控等諸多方面[13-14]。

維生素C作為一種機體必須的小分子活性物質，發揮重要作用是人體必須的一種營養物質[9]。研究顯示，VC具有一定的抗腫瘤效應，這包括VC直接對腫瘤細胞的抑制、凋亡影響，但前提是在高濃度VC的情況下[2,10]；而另一方面，VC可調控機體免疫系統[15]，近年來以VC為基礎的免疫調控機制研究越來越受到研究學者的重視，并且取得了顯著成果。VC可促進T細胞成熟，并且促使CD4+T細胞向Th1型增殖、分化的同時，研究學者還發現VC可促進CD3+CD8+T細胞記憶功能的提升[16]，而上述免疫調控反應卻是以DC細胞為基礎的，即VC通過調控DC功能進而影響T細胞分化（直接用VC影響T細胞沒有上述調節功能）。我課題組前期研究結果顯示（已接收），VC可顯著提升DC細胞表面CD80、CD86、HLA-DR表達，同時我課題組還發現VC可顯著刺激DC表面CD40表達，這揭示DC可能通過VC的氧化-還原調控能力影響DC細胞分化、成熟及功能，進而影響T細胞亞群及免疫功能。過繼免疫治療是目前應用程度相當廣泛的治療方式，為了快速擴增CD3+T細胞，在培養過程當中一般添加anti-CD3+單克隆抗體，而培養的細胞主要以CD8+T細胞為主。本研究發現，在anti-CD3+單克隆抗體培養體系中，利用VC預處理DC，之后再與T細胞混合培養，其CD40L、CD8+CD28+T細胞亞群會顯著升高，表明VC-DC可顯著激活活性T細胞的比例，向非特異性CTL方向分化，并且CD8+T細胞因子IFN-γ、IL-2分泌能力也會有顯著升高，同時Th2細胞分泌IL-4能力顯著降低，并且呈現出對VC的濃度依賴性。而后續腫瘤細胞株殺傷檢測也證實上述結論。

既往研究顯示，VC通過調節DC細胞功能，可提升CD4+T細胞分化，而本研究中未有明顯體現（圖2），這很可能是anti-CD3+單克隆抗體的添加，使得T細胞快速、大量擴增，而其中主要以激活CD8+T細胞增殖為主，因此掩蓋的VC-DC對CD4+T細胞的調控能力，但從流式檢測細胞因子情況分析來看，除CD8+細胞因子分泌能力顯著提高外，IFN-γ+CD8-T、IL-2+CD8-T細胞分泌情況也有明顯提高（圖4），而IL-4+CD8-T細胞變化不明顯，無顯著意義（P>0.5），這也證實了VC-DC對CD4+T體現相同的調控作用。因此，VC的利用對于過繼免疫細胞治療具有很好的調節促進作用，可作為細胞培養中添加的一種類激動劑。而VC在免疫功能調控中發揮的作用以及其對免疫信號通路的影響，我們還將做進一步研究。

作者：賈原 李文麗 韓亞萍 李芳 張俊萍 單位：山西大醫院腫瘤生物治療科