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摘要：目的：研究溫度、pH、金屬離子對納豆激酶穩定性的影響。方法：采用瓊脂糖—纖維蛋白平板法測定活性。結果：納豆激酶在低于40℃相對穩定，高于45℃時活性下降趨勢明顯，55℃活性完全喪失；納豆激酶的最適pH為7.0，在6.0~9.0相對穩定；Mg2+、Ca2+、Na+對于NK有明顯的激活作用，低濃度K+沒有明顯的激活或抑制作用，高濃度的K+對納豆激酶的活性有抑制作用，Fe2+、Zn2+、Cu2+、Ba2+、Al3+、Mn2+對NK的活性有不同的抑制作用。結論：納豆激酶的保存溫度要低于40℃，pH值在6.0~9.0的環境下，也可適當加入Mg2+、Ca2+、Na+增加NK的穩定性。

關鍵詞：納豆激酶；穩定性；纖溶活性

隨著社會的發展，人們生活水平日益提高，生活壓力加大以及高脂肪、高熱量食物攝入過多，全球心腦血管血栓性疾病的臨床發病率也變的越來越高，心梗、脈管栓塞[1]等均為其引起的常見突發性疾病，已經嚴重危害著人們的生命健康。根據WHO統計每年約有300萬人死于心血管疾病，而且已經開始向低齡化趨勢發展，嚴重影響了人們的生命健康和生活質量[2]，預計2020年因心腦血管而死亡的人數將會達到2500萬[3]。因此，如何解決血栓性疾病的預防和治療問題已經成為科學家和老百姓們關注的焦點。目前，臨床上用于治療血栓性疾病的藥物主要有尿激酶、鏈激酶、組織性纖溶酶原激活劑等。它們均存在毒副作用大、半衰期短、不易被人體吸收等缺點[4]。而納豆激酶因為來源于大豆的發酵產物而具有安全無毒的特點，半衰期也長（是尿激酶的19倍以上）可達8~12h[5]。它是在1987年被日本學者須見洋行等[6]從納豆中提取并命名的一種具有溶解血栓作用的酶制劑。納豆激酶（Nattokinase，NK）是由納豆枯草芽孢桿菌（Bacillussubtillis/natto）分泌產生的一種堿性絲氨酸蛋白酶，具有纖溶效應，溶解血栓作用顯著[6]。納豆激酶是一種分子量在27~28kDa的蛋白質，其等電點（PI）在8.6左右。其活性中心位點在Asp-32、His-64和Ser221，與底物產生活性位點的有Ser125、Leu126及Gly127[7]。納豆激酶作為預防和治療血栓性疾病藥物具有安全性高、半衰期長、易于口服等優勢[8]。由于這些優點，納豆激酶在食品、保健品和藥品開發方面具有很大的潛能。目前有膠囊[9]、軟膠囊、片劑[10]、微囊[11]、咀嚼片[12]、泡騰片[13]、微丸[14]、口服液[15]、顆粒[16]等劑型。其中，膠囊、軟膠囊、片劑從最早只有日本大和制藥公司生產的納豆激酶膠囊和金之納納豆膠囊到我國湖南貴生坊生產的納豆素膠囊、北京龍興生產的納豆激酶膠囊、北京燕京中發生產的燕京牌納豆、天津寶恒生物公司的蛋白硒納豆膠囊以及天津百德公司生產的納豆咀嚼片，這是一個較大的進步。微囊、微丸和口服液也已有專利發明。除了藥品之外，還有特別口味的麻辣味納豆[17]已有研究，納豆醬已經出現在了人們的生活中，相信不久會有更多不同口味的含有納豆激酶的產品和食品會出現在人們的生活中和飯桌上。然而，納豆激酶在具有專一性和高催化效率的同時也具有對酸、堿、熱以及金屬離子等穩定性差的特點。目前有報道溫度在25℃[18]、40℃[11]、45℃[19]、50℃[20]時活性最高且穩定性最好，在55℃[11]、60℃[18]時納豆激酶就會完全失去活性。有研究者通過在空間結構引入二硫鍵也沒能增加其熱穩定性[21]。除了溫度之外，pH也是影響納豆激酶穩定性的一個重要因素，原因是蛋白質在一定的pH條件下所含一定量的正電荷基團或負電基團會隨著pH的變化而變化，從而對納豆激酶的活性產生一定影響[11]。據文獻報道納豆激酶pH穩定范圍在4.5-9.5[11，18-19]。最適pH為5[19]、6.5[11]、7.5[18]。另外，金屬離子對納豆激酶的穩定性也有較大影響，據文獻報道金屬離子Mg2+[11，22-24]、Co2+[24-25]、Ca2+[11，20，23，26]、Na+[11]、K+[22，25]對納豆激酶具有激活穩定作用，而且還發現Mg2+對納豆激酶的激活促進作用在國內基本是沒有異議，但是國外有文獻報道Mg2+[19]對納豆激酶具有抑制作用，也有文獻報道Ca2+[11，22]、Co2+[20，23]對納豆激酶有抑制作用，而金屬離子Na+[23]、K+[11]對納豆激酶沒有明顯的穩定或抑制作用；對于金屬離子Cu2+[11，20，22-25]、Zn2+[11，20，22-25]、Fe2+[11，20，22-25]、Al3+[23]、Mn2+[23]的報道多為具有抑制納豆激酶活性作用。也有文獻報道稱：金屬離子Fe2+對納豆激酶并沒有明顯的激活或抑制作用[25]。也有報道指出金屬離子Mn2+對納豆激酶具有激活作用[19]。因此對于納豆激酶的穩定性還需進一步的研究，為之后的保護劑篩選及劑型的制備提供依據和基礎。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1主要儀器恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠），AB135-S電子天平（梅特勒—托利多儀器有限公司），AL204型電子天平[梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司]，TD-10002B電子天平（天津天馬衡基儀器有限公司），渦旋混合器[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]，游標卡尺（金華市美耐特工具有限公司），pHSJ-5pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司），單道可調量移液槍（賽默飛世爾熱電有限公司），HH-B11-420生化培養箱（上海一恒科學儀器有限公司），超聲波清洗機（寧波新芝生物科技有限公司）。

1.1.2主要試劑氯化鉀、氯化鎂、氯化鈣、氯化鋅、硫酸銅、氯化錳、氯化鋁、氯化鋇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉均來自天津市風船化學試劑科技有限公司，氯化鈉、檸檬酸和檸檬酸鈉來自天津科密歐化學試劑有限公司，氯化亞鐵來自天津博迪化工股份有限公司，PBS（pH=7.2）、尿激酶、纖維蛋白原、凝血酶均來自于北京索萊寶科技有限公司，瓊脂糖來自上海玉博科技有限公司。

1.1.3納豆激酶由本實驗室采用液體發酵生產制得。

1.2實驗方法

1.2.1納豆激酶活力的測定參照Astrup法[27]制備瓊脂糖—纖維蛋白平板，在平板完全凝固后（約1h），用6mm打孔器打孔，每孔加入10μL樣品放置37℃恒溫箱中保溫放置18h，測量透明圈不同三處直徑取平均值求出溶圈面積，由于溶圈面積的大小和納豆激酶的活性成線性關系，所以本實驗直接采用納豆激酶的溶圈面積大小來表示其活性大小。

1.2.2溫度對納豆激酶的影響將實驗室自制的納豆激酶酶液分別于4、25、37、40、45、50、55、60、65℃條件下保溫放置1h后，用纖維蛋白—瓊脂糖平板法測定其活性，測量透明圈不同三處直徑取平均值求出溶圈面積，其中溶圈面積最大的為其最適保存溫度。

1.2.3保溫時間對納豆激酶的影響將納豆激酶液分別放置于4、25、37、40、45、50、55、60、65℃環境下保溫，放置10h，每隔1h取樣并存放于4℃保存，直至10h結束后利用瓊脂糖—纖維蛋白平板法測定活性，測量透明圈不同三處直徑取平均值求出溶圈面積，以4℃酶液的活性為對照，確定不同溫度下不同時間的活性變化。

1.2.4納豆激酶的最適pH的測定配制不同pH（3.0~11.0）的緩沖液，將配好的各緩沖溶液分別與粗酶液按1∶1的比例混合，用瓊脂糖—纖維蛋白平板法測定不同pH值下的酶活，測量透明圈不同三處直徑取平均值求出溶圈面積，其中溶圈面積最大的為其最適pH。緩沖液的配制：pH=3的緩沖液：移液槍分別吸取1mol/L檸檬酸18.60mL，0.1mol/L檸檬酸1.40mL，混合，蒸餾水定容至20mL，渦旋混勻。pH=4的緩沖液：移液槍分別吸取1mol/L檸檬酸13.10mL，0.1mol/L檸檬酸6.90mL，混合，蒸餾水定容至20mL，渦旋混勻。pH=5的緩沖液：移液槍分別吸取1mol/L檸檬酸8.20mL，0.1mol/L檸檬酸11.80mL，混合，蒸餾水定容至20mL，渦旋混勻。pH=6的緩沖液：移液槍分別吸取0.2mol/LNa2HPO412.30mL，0.2mol/LNaH2PO487.70mL，混合，蒸餾水定容至100mL，渦旋混勻。pH=7的緩沖液：移液槍分別吸取0.2mol/LNa2HPO461.00mL，0.2mol/LNaH2PO439.00mL，混合，蒸餾水定容至100mL，渦旋混勻。pH=8的緩沖液：移液槍分別吸取濃度為0.2mol/LNa2HPO494.70mL，0.2mol/LNaH2PO45.30mL，混合，蒸餾水定容至100mL，渦旋混勻。pH=9的緩沖液：移液槍分別吸取濃度為0.1mol/LNa2CO31.00mL，0.1mol/LNaHCO39.00mL，混合，蒸餾水定容至10mL，渦旋混勻。pH=10的緩沖液：移液槍分別吸取濃度為0.1mol/LNa2CO37.00mL，0.1mol/LNaHCO33.00mL，蒸餾水定容至10mL，渦旋混勻。pH=11的緩沖液：移液槍分別吸取濃度為0.1mol/LNa2CO39.00mL，0.1mol/LNaHCO31.00mL，混合，蒸餾水定容至10mL，渦旋混勻。

1.2.5pH對納豆激酶穩定性的影響納豆激酶對于pH的要求較高，過酸過堿均會影響它的活性。將“1.2.3”項下配制好的不同pH值緩沖溶液分別與粗酶液按1∶1的比例混合，4℃放置2h后，用瓊脂糖—纖維蛋白平板法測定其酶活，測量透明圈不同三處直徑取平均值求出溶圈面積，其中活性最大的為其穩定pH。1.2.6不同金屬離子對納豆激酶的影響分別稱取適量CaCl2、MgCl2、FeCl2、KCl、NaCl、ZnCl2、CuSO4、BaCl2、AlCl3、MnCl2·4H2O的鹽，配制成50mmol/L的鹽溶液。使鹽溶液與粗酶液恰當的混合，使金屬離子的最終濃度分別為5、10mmol/L并以加PBS的酶溶液為對照。在4℃環境下靜置1h后，用瓊脂糖—纖維蛋白平板法測定其酶活，測量透明圈不同三處直徑取平均值求出溶圈面積。

2結果

2.1溫度對納豆激酶的影響納豆激酶的活性總趨勢是隨著溫度的升高而降低，4、25、37℃對納豆激酶活性的影響相對較小，45℃時活性下降較為明顯，50℃時還具有一半的活性，當溫度達到55℃時開始有白色沉淀產生，活性完全喪失，說明白色沉淀就是納豆激酶因為高溫變性產生的。

2.2保溫時間對納豆激酶的影響隨著溫度和保溫時間的增加納豆激酶活性呈下降的趨勢，其中55℃1h完全失去活性，50℃時7h內仍有活性，7h之后納豆激酶的活性因為沉淀的產生完全喪失；45℃酶活下降相對明顯；40℃時納豆激酶的活性隨著保溫時間的延長緩慢下降；4、25、37℃時隨著保溫時間的延長其活性變化不明顯，從而說明對于納豆激酶的保存溫度越低活性損失越少，短期內保存最好低于40℃，長期保存最好低于37℃。

2.3納豆激酶最適pH的測定由圖3可以看出，納豆激酶的最適pH為7.0；pH在3.0~11.0范圍內，納豆激酶的活性趨勢呈現先增加后下降，pH=7.0為轉折點，pH=7.0之前呈上升趨勢，pH=7.0之后呈下降趨勢，但pH=11.0活性略高于pH=3.0，這可能與納豆激酶是堿性蛋白酶有關。時間的增加對納豆激酶的活性沒有影響，堿性環境下較酸性環境活性損失相對較少，從而說明對于納豆激酶的長期保存最好在稍偏于堿性環境中，也說明了納豆激酶適合做成腸溶膠囊或者片劑。

2.5不同金屬離子對納豆激酶的影響高、低濃度的金屬離子Mg2+、Ca2+、Na+對于納豆激酶的活性均具有明顯的激活作用，低濃度較高濃度對納豆激酶的激活作用更加明顯；低濃度的K+對納豆激酶的活性無明顯作用，而高濃度的K+卻對其有抑制作用；金屬離子Fe2+、Zn2+、Cu2+、Ba2+、Al3+、Mn2+對納豆激酶的活性均有不同程度的抑制作用，而且與高、低濃度無關，其中Fe2+、Al3+對納豆激酶活性的抑制作用相對明顯。

3結論

納豆激酶一般在不高于45℃時活性較為穩定，高于45℃時活性下降趨勢明顯，在50℃保溫1h仍可以保持一半的活性，55℃時納豆激酶的活性完全喪失；在低于40℃納豆激酶可以較長時間的保持活性，在45℃時納豆激酶的活性下降明顯，并隨著時間的延長活性呈穩定下降趨勢，50℃7h內仍有活性，但在55℃保溫1h活性完全失去；納豆激酶的最適pH為7.0，在6.0~9.0范圍內活性相對穩定；金屬離子Mg2+、Ca2+和Na+對于納豆激酶具有明顯的激活作用，低濃度K+沒有明顯的激活或抑制作用，高濃度的K+對納豆激酶的活性有抑制作用，而金屬離子Fe2+、Zn2+、Cu2+、Ba2+、Al3+、Mn2+無論是低濃度還是高濃度對納豆激酶的活性都有不同的抑制作用，其中Fe2+、Al3+對納豆激酶活性的抑制作用相對明顯。實驗結果說明納豆激酶不會因為體溫使其活性降低，腸溶膠囊或腸溶片是保護納豆激酶不被胃酸破壞的有效方法。因為納豆激酶存在不穩定的特性，為工業化大規模生產帶來了不便。目前對于提高酶穩定性的方法是通過改造其分子結構，比如通過化學手段進行結構的修飾從而改變其理化性質，或是融合其它酶的基因片斷使其具有其它酶穩定的性質或是通過改變基因上的堿基順序和組成[28]。劉中美等[29]通過定位突變找到了可以顯著提高納豆激酶熱穩定的突變體P14L和N76D，但是發現在增加納豆激酶熱穩定性的同時其活性也有所下降。這是由于酶催化活性的空間構象與酶熱穩定性空間構象不同的緣故，前者空間結構具有柔性而后者結構需要剛性，當其具有柔性的空間結構被破環了活性也就降低了。南京農業大學研究[30]發現了既能提高納豆激酶的熱穩定性又會增加其活性的突變體，就是納豆激酶的第36位氨基酸Asp被Gly替代后，納豆激酶的熱穩定性就會提高至原來的1.2倍，同時比活力也提高了16.6%，推測熱穩定的提高可能與Gly所帶的電荷有關，因為帶負電荷的氨基酸Asp對溫度比較敏感，高溫會使其肽鍵水解，從而引起蛋白質空間結構的變化，而Gly所帶電荷為中性比較穩定；比活力的提高可能與Gly的電子云密度有關，帶有巨大側鏈的氨基酸Asp被無側鏈的Gly代替后，使周邊的電子云密度減小，對空間位阻的影響也減小，使底物更容易接觸其活性中心，從而使活性明顯增加。山東農業大學[31]在提高納豆激酶pH穩定性方面進行了研究，也利用定位突變法找到了5個突變體，分別是S182W、S182L、S182K、L203E和L203K，發現納豆激酶的pH穩定性與堿基的替換有關，酸、堿性氨基酸分別有利于納豆激酶在酸、堿性條件內保持活性穩定。從目前研究來看，通過基因手段提高納豆激酶的穩定性具有可行性，通過對選取的納豆激酶的基因進行優化并將其載到畢赤酵母菌中表達來提高產酶量也可實現[32]。這彌補了納豆激酶作為溶栓藥產量低和穩定性差的缺陷，為納豆激酶成為新一代預防和治療血栓藥邁出了一大步，筆者相信納豆激酶終究有一天會替代臨床上治療血栓疾病的其它藥物，它在保健品和食品方面還有很大的研究和開發價值。

作者：楊亞楠1，陳慧潔1，余河水1，丁輝2，張麗娟1，宋新波2 單位：1.天津中醫藥大學，2.天津中一制藥有限公司